表1 9联检法检测呼吸道感染病原体分布构成比
Tab.1 IFA in detection of respiratory tract infection pathogens
·临床研究·
伏昱璇， 谷 丽， 杨 蓉
(同济大学附属第十人民医院儿科，上海 200072)
【摘要】目的 探讨临床中呼吸道病原体9联检与咽拭子培养在儿科呼吸道疾病中的临床应用。方法 选择本科2014年1月至2015年9月住院诊断为急性呼吸道感染患儿319例，对其进行呼吸道病原体9联检与咽拭子培养两种检测的方法进行检测，分析病原体检测情况。结果 共检测出6种病原体，肺炎支原体112例(35.1%),乙型流感病毒62例(19.4%)，副流感病毒7例(2.2%)，军团菌2例(0.6%)，腺病毒1例(0.3%)，立克次体1例(0.3%)。142例咽拭子培养取样成功。只有2例检测出鲍曼不动杆菌，其他均为口咽部正常菌群。结论 肺炎支原体、乙型流感病毒在本地区小儿呼吸道感染中高发。9种呼吸道病原IgM抗体在小儿呼吸道感染检测中检出阳性率高，检测的病原体种类多，发现病原体时间早，操作简单，对临床的及时诊断、治疗及用药有十分重要的意义。
【关键词】呼吸道病原体9联检； 咽拭子培养； 小儿呼吸道感染； 临床应用
全球统计资料显示，5岁以下小儿每年死亡1000 万，发展中国家占99%，其中肺炎是主要死亡原因之一[1]。在5岁以下死亡的儿童中肺炎致死率占18.1%，对发展中国家来说甚至可以升高至26%[2]。加强该病的诊断在临床中具有重要的意义。传统的方法，比如痰液培养及咽拭子培养，痰培养其检出率并不是很高，且小儿不会咳吐出痰液，操作也比较麻烦，且在整个的操作过程中很容易受到其他因素的影响，从而造成阳性率比较低[3]。咽拭子培养虽然操作简单，但主要上呼吸道感染致病菌检测，受多种因素影响，正常口腔内定植正常菌，即使分离出来的细菌未必与疾病相关，临床应用意义不大。因此，临床中如何提高该病的诊断率是医师们关注的重点。随着医疗水平的不断发展和科学技术的不断完善，呼吸道感染病原体9联合检测方法逐渐得到临床中应用，这种检查方法对常见的9种病原体类型进行分析，合理地判断出感染的类型，且操作也比较简单准确[4]。
本研究通过调查分析本院住院小儿急性呼吸道感染319例的病原体分布情况，为临床用药提供病原学依据，以便更有效地治疗小儿呼吸道感染，做到因病施治，缩短治疗过程，减轻患儿痛苦。
1.1 一般资料
选择本科2014年1月至2015年9月住院诊断为急性呼吸道感染患儿319例，上呼吸道感染62例(19.4%),下呼吸道感染257例(80.6%)，其中男187例，女132例，男女之比为1.41∶1。年龄1岁以下52例(16.3%)，1～3岁132例(41.4%)，3岁以上135例(42.3%)。
1.2 方法
1.2.1 9联检测方法 采取间接免疫荧光法检测，试剂和试剂盒均由郑州安图生物科技发展有限公司所提供[5]。
标本处理： 采集患者空腹静脉血2.0ml，分别取15μl血清和15μl PBS液加入1.5ml塑料安瓿管中，震荡充分混匀。用抗人球蛋白IgG吸附剂150μl 加入30μl混合液中，彻底混匀，处理后的血清离心半径10cm，3000r/min ，离心15min，除去沉淀。
操作过程： 在载玻片的9孔中每孔加15μl吸附剂处理过的血清标本。在1个载玻片加入15μl阳性对照，另1个加15μl阴性对照。将载玻片放湿盒，37℃温育1h以上。用PBS洗液缓慢来回冲洗3次以上，避免直接对标本孔冲洗，然后浸泡在足量PBS液中放置摇床轻摇10min。取出用蒸馏水缓慢水流冲洗。载玻片自然风干后每孔加入 15μl FITC结合物溶液，将载玻片放入湿盒，37℃温育30min。取出载玻片，用PBS洗液缓慢流水冲洗，然后浸泡在PBS中并放置在水平摇床上轻轻摇动10min，自然风干，加适量封片介质，小心盖上载玻片。最后用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。
注意事项： 严格按照实验操作说明书操作，PBS洗液需要事先配置，摇匀直至充分溶解，配好后储存于2～8℃备用，2d内用完，有沉淀弃去重配。观察结果要快速，需要有专人审核复检，以免误判误认，结合操作手册，建立本实验室的判断标准。
9联检测的病原菌类型有[6]： (1) 嗜肺军团菌；(2) 肺炎支原体；(3) 立克次体肺；(4) 炎衣原体；(5) 腺病毒；(6) 呼吸道合胞病毒；(7) 甲型流感病毒；(8) 乙型流感病毒；(9) 副流感病毒。
1.2.2 咽拭子培养方法 采取无菌咽拭子培养管(Amies运送培养基)，嘱小儿张口发“啊”音，暴露咽喉，用培养管内的消毒长棉签以灵敏而轻柔的动作擦拭两侧腭弓和咽、扁桃体上的分泌物，插入培养基中，密闭进行分离培养鉴定，均严格地按照操作规程进行操作。
1.2.3 细菌判断 细菌分离培养后用的细菌鉴定仪型号为全自动微生物鉴定/药敏分析系统—VITEK 2 Compact。
319例呼吸道感染的住院患儿进行呼吸道病原9联检测。共检测出6种病原体，肺炎支原体112例(35.1%),乙型流感病毒62例(19.4%)，副流感病毒7例(2.2%)，军团菌2例(0.6%)，腺病毒1例(0.3%)，立克次体1例(0.3%)，见表1。因取样的困难，只有142例咽拭子培养取样成功。有2例检测出鲍曼不动杆菌，其他均为口咽部正常菌群。
表1 9联检法检测呼吸道感染病原体分布构成比
Tab.1 IFA in detection of respiratory tract infection pathogens
呼吸道感染是儿科的常见病、多发病，发病率在我国小儿各类疾病中占首位，其病原体包括病毒、细菌、支原体等。据统计，在住院患儿中上、下呼吸道感染占60%以上，是我国5岁以下儿童第一位的死亡原因[7]。为了减低小儿呼吸道感染的死亡率，保护小儿生命健康，对于病原体的检测尤为重要。近年由于抗生素的广泛应用，病原体的变异及流行病学的改变等多种因素的影响，各种病原体在小儿呼吸道感染的比例均有所变化[8]，给临床准确用药、对症治疗造成一定困难，传统的检测方法以痰培养及咽拭子培养为主，但是其操作比较麻烦，且很容易受到其他因素的干扰，从而降低诊断效果[9]，逐渐地被分子检测技术而替代。本研究中也提示咽拭子培养阴性率高。针对各种病原体感染后血清抗体的变化，并结合IgM抗体的特点选择了9联检这种试剂，仅需一份血清即可对呼吸道感染中的9种病原体进行检测，这种检测方法不仅能够有效地发现致病因子，还能够对出现有多个病原体感染的患者进行准确的诊断[10]。另外，采取的9联检测这种新的检测方法采取的是间接免疫荧光法，大大地提高诊断的效果[11]。通过检测结果，指导临床治疗用药。
本研究中，肺炎支原体是最常见的感染病原体。从近几年的研究结果看，发病率和流行不断增加，而且症状也有不断加重、并发症不断增多的趋势[12-13]，本研究与之一致。在本研究中共发现肺炎支原体112例，占总病人数35.1%。引起小儿呼吸道感染的另一大类病原体是病毒，本检测方法共包括腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒5种病毒。其中以乙型流感病毒感染率最高，共62例，占检测出病毒总数的88.5%，与既往文献一致[14-17]。通过以上分析，肺炎支原体、乙型流感病毒在本地区小儿呼吸道感染中高发[3]。本次9项呼吸道病原体检测均为IgM，儿童呼吸道感染后首先出现IgM抗体，通常认为在病毒感染1周后出现，7～14d达到高峰，表明有近期感染，在血清持续时间较短，一般为1～3个月，IgM是近期感染的有效标志物。采用间接免疫荧光法检测呼吸道病毒特异性IgM，可以提供呼吸道病毒感染血清学证据，分析呼吸道病原的流行病学特点，帮助指导临床合理用药。
9种呼吸道病原IgM抗体在小儿呼吸道感染检测中检出阳性率高，检测的病原体种类多，发现病原体时间早，操作简单，对临床的及时诊断、治疗及用药有十分重要的意义[18-19]。
9联检试剂虽然可以同时检测9项病原，但是儿童呼吸道感染病原并不能全部检测，还需要多种检验技术的配合应用，才能作出更加合理的诊断，并且该试验必须同时检测9种病毒，医生不能面对患者症状分析并单独开具某种病毒检测，客观上相对增加了患儿家长的负担，需要在这方面适当改进，使这种试剂技术更好地服务于临床，服务于患儿。
【参考文献】
[1] Qin Q, Shen KL. Community-acquired pneumonia and its complications[J]. Imdian J Pediatr,2015,82(8): 745-751.
[2] Enarson PM, Enarson DA, Gie R. Management of the child with cough or difficult breathing[J].Int J Tuberc Lung Dis,2005,9(7): 727-732.
[3] 胡旭，刘红霞.9种病原体IgM抗体联合检测在小儿呼吸道感染中的临床实验研究[J].中国医学创新，2013，12(25): 88-89.
[4] 吉祖活，梁少君，魏庆,等.呼吸道病原体9联检试剂的应用价值[J].检验医学与临床，2013，10(10): 1306.
[5] 胡英会，张景亮，杨继红.呼吸道感染IgM联检试剂盒临床应用评价[J].公共卫生与预防医学，2013，24(2): 105.
[6] 秦茵茵，吴国锋，秦笙.9项呼吸道联检试剂对多种呼吸道感染病原体检测的临床意义[J].中华生物医学工程杂志，2012，18(2): 124-127.
[7] 王卫平，沈晓明.儿科学[M]北京: 人民卫生出版社，2012.
[8] 卢宇明，李欢，刘慧,等.9项呼吸道病原体检测在小儿呼吸道感染中的诊断价值[J].中外医疗，2015(2): 171-172.
[9] 贺占国，王曼，白云,等.IgM抗体检测任儿科呼吸道感染性疾病诊断中的应用[J].临床误诊误治，2012，25(6): 63-65.
[10] Ghanaiem H, Averbuch D, Koplewitz BZ, et al. An outbreak of adenovirus type 7 in a residential facility for severely disabled children[J]. Pediatr Infect Dis J， 2011,30(11): 948-952.
[11] 董玉琳.呼吸道病原体9联检在小儿急性呼吸道疾病中的应用[J].中外医疗，2012，31(33): 170-172.
[12] 崔赛男，谷丽，杨蓉,等.儿童重症肺炎支原体肺炎临床特征与疗效观察[J].同济大学学报: 医学版，2013,8(4): 94-97，103.
[13] 李呈媚，谷丽，殷少军，等.不同年龄段支原体肺炎合并心肌损害程度的分析[J].同济大学学报： 医学版，2013,6(3): 44-48.
[14] 何成禄，徐从琼，王玉明，等.呼吸道9联检IgM检测对儿童急性下呼吸道感染的早期诊断价值[J].昆明医科大学学报，2014,35(11): 129-132.
[15] 袁艳，苏信斌.呼吸道9联检检测小儿急性肺炎病原体分布特点的调查分析[J].吉林医学，2014(28): 6217-6218.
[16] Friedman JN， Rieder MJ， Walton JM. Bronchiolitis： rec ommendations for diagnosis， monitoring and management of children one to 24 months of age[J]. Paediatr Child Health，2014，19(9)： 485-498.
[17] Geng J， Guo WL， Zhang XL. Prevalence of respiratory syncytial virus infection in hospitalized children at a children’s hospital and effects of climate change on the prevalence in Suzhou， China[J]. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi，2015，17(5)： 482-486.
[18] 蒙桂文.肺炎支原体抗体检测对婴幼儿呼吸道感染的临床应用[J].检验医学与临床，2013，10(8)： 955-956.
[19] Hung KH， Lin LH. Adenovirus pneumonia complicated with acute respiratory distress syndrome： a case report[J].Medicine(Bahinlore)，2015，94(20)： e776.
Indirect immunofluorescent assay and pharyngeal swab culture in clinical application for pediatric respiratory tract infection
FU Yu-xuan， GU Li， YANG Rong
(Dept. of Paediatrics, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)
【Abstract】Objective To compare indirect immnofluorescent assay (IFA) of 9 respiratory tract pathogens with pharyngeal swab culture in clinical application for pediatric respiratory infectious diseases. Methods Total 319 children with respiratory tract infections admitted in hospital from January 2014 to September 2015 were enrolled in the study. Patients underwent IFA for detection of 9 pathogens with Vircell kits, and pharyngeal swab culture. The results of two methods were compared. Results Six species of pathogens were detected in 185 cases with IFA method: mycoplasma pneumonia in 112 cases (35.1%), influenza B virus in 62 cases (19.4%), parainfluenza virus in 7 cases (2.2%), Legionella in 2 cases (0.6%), adenovirus in 1 case (0.3%), Rickettsia in 1 case(0.3%). Pharyngeal swab culture was successful in 142 cases, but only Bauman’s bacteria were detected in 2 cases, the others are normal mouth microbial flora. Conclusion The immunofluorescent assay for nine respiratory tract pathogens can increase the detective rate of pathogens in children with respiratory tract infection.
【Key words】respiratory tract Pathogens nine JIU; pharyngeal swab culture testing; respiratory tract infection in children; clinical application
doi：10.16118/j.1008-0392.2016.03.018
收稿日期：2015-11-04
作者简介：伏昱璇(1973—)，女，副主任医生，硕士.E-mail: fyy_929@163.com
通信作者：谷 丽.E-mail: fyy_929@163.com
【中图分类号】R 722.13
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2016)03-0087-04