烟碱型乙酰胆碱受体基因多态性与NSCLC的相关性研究

【摘要】目的探讨烟碱型乙酰胆碱受体a5(nicotine acetylcholine receptor subunits alpha5, CHRNA5)基因-1640 C/T (rs3829787)单核苷酸多态性与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)易感性的关系。方法应用聚合酶链式反应和Sanger测序方法，检测102例非小细胞肺癌患者和131例健康对照者CHRNA5基因-1640C/T位点基因型分布情况，观察该位点基因多态性是否与非小细胞肺癌发病及病理类型相关。结果两组人群均存在CHRNA5基因-1640C/T多态性；两组人群基因型、等位基因频率差异存在统计学意义，肺癌组CT+TT基因型、T等位基因频率均高于对照组(P<0.05)；基因型频率的相对风险分析发现，CT、TT基因型各自患肺癌的风险分别是CC基因型的1.77倍(95%CI： 0.93～3.36)和4.70倍(95%CI： 1.23～17.99)；-1640T在肺腺癌中分布频率较非腺癌中高(P<0.05)。结论 CHRNA5基因-1640C/T多态性可能与非小细胞肺癌易感性相关，该位点携带T等位基因的吸烟人群可能更容易发生肺癌，尤其是肺腺癌。

【关键词】非小细胞肺肿瘤；烟碱型乙酰胆碱受体a5基因；单核苷酸多态性；等位基因

肺癌是当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一，是一种严重威胁人民健康和生命的疾病。90%的肺癌与吸烟暴露有关[1]。研究表明[2]，人类第15号染色体长臂15q24-25区域上编码的烟碱型乙酰胆碱受体候选基因，即尼古丁受体家族(CHRNA3、CHRNA5、CHRNB4)，表达于支气管上皮，由尼古丁激活，参与调节肺部炎症反应，其基因多态性与吸烟相关的肺癌的发生发展关系密切。目前国内有关非小细胞肺癌CHRNA5基因多态性的相关报道还并不完善。本研究通过分析CHRNA5-1640C/T的基因多态性特点，研究其与吸烟非小细胞肺癌人群的发病及疾病病理类型的相关性。

1 资料与方法

非小细胞肺癌组(以下简称肺癌组)选自同济大学附属东方医院2013年10月至2014年10月期间呼吸内科住院和门诊患者共计102名，均为男性，年龄58～79岁。所有病例均符合相关病理诊断标准，并根据病理结果分为肺腺癌组和非腺癌组，均为初治患者，分期为Ⅰb～Ⅲb期不等，无哮喘、肺间质纤维化、支气管扩张等肺部疾病，无合并其他恶性肿瘤病史。

对照组选自本院呼吸科门诊及体检中心等，共计131名，男性，年龄59～74岁，所有研究对象均经过详细的病史询问和全面的体格检查，并排除哮喘、肺间质纤维化、支气管扩张等肺病疾病，无肺部及其他部位恶性肿瘤史。

两组对象均没有血缘关系的中国汉族人群，要求为持续吸烟且目前尚未戒烟患者(吸烟指数>200支年)。两组对象年龄差异无统计学意义(P<0.05)。所有受试者均签署知情同意。

1.2.1 标本采集清晨空腹采集受试者(肺癌组和对照组)外周静脉血3ml，以20μl 0.5mol/L EDTA管抗凝，-70℃保存待检测，避免反复冻融。

1.2.2 全血白细胞基因组DNA的提取用TIANamp Genomic DNA kit(DP 304，天根生化公司)，按照说明书离心柱法抽提全血白细胞基因组DNA，注意操作，避免样本间交叉污染。

1.2.3 抽提的DNA纯度分析使用分光光度计检测所有样本的D值，达标后将样本稀释到工作浓度后-20℃保存待用。

1.2.4 DNA片段聚合酶链反应(PCR)扩增扩增CHRNA5-1640 C/T位点的PCR引物序列利用primer3软件设计，由上海生工合成，上游5′-TTTAGGGGAACTTTGTAGGTGGT-3′，下游5′-TTTACTCTGAAGAATTTATGGGACTT-3′，扩增的DNA片段长度为529bp。上下游引物各1μl，按照GoTaq G2 Colorless Master Mix(Promega)使用说明书配置50μl体系。PCR使用Veriti 96-Well Thermal Cyclery(ABI)，反应条件为： 95℃预变性5min后，以 95℃变性 30s，62℃退火至 55℃ 30s，72℃延伸40s为一个循环，共15个循环，最后再72℃延伸10min。PCR产物4℃保存。结果见图1。

图1 CHRNA5-1640C/T PCR结果
Fig.1 The PCR results of CHRNA5-1640C/T gene

1.2.5 Sanger双脱氧法测列分析采用3500XL(ABI)测序仪。根据测序结果进行基因组分型，可分为CC、CT、TT三种类型。

所有统计学分析均采用SPSS 19分析软件，以P<0.05为显著性标准。计量资料用

表示。组间一般临床资料的比较采用t检验。研究对象基因型与Hardy-Weinberg平衡的符合程度、组间人群基因型与等位基因频率的比较均采用χ2检验。分析各位点多态性与患病风险的关联以logistics回归分析的比值比(odds radio， OR)及其95%可信区间(CI)表示。

2 结果

两组研究对象均可检测到预计的529bp的基因片段，且均符合Hardy-Weinberg平衡检验(P>0.05)，具有较好的群体代表性。本研究发现CHRNA5-1640C/T在两组间均存在CC、CT、TT三种基因类型，经χ2检验，肺癌组基因型、等位基因频率分布各自与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1，CT、TT基因型、T等位基因频率均高于对照组，而CC基因型频率、C等位基因频率均低于对照组，见表1、2。

表1 肺肿瘤组与对照组CHRNA5基因-1640C/T位点基因型频率分布比较

Tab.1 Comparison of genotype frequency between NSCLC group and control group

表2 肺肿瘤组与对照组CHRNA5基因-1640C/T位点等位基因频率分布比较

Tab.2 Comparison of allele frequency between NSCLC group and control group

将CC型与含有T等位基因的CT+TT型基因型频率进行分析比较后发现，在肺癌组和对照组之间存在统计学差异(P<0.05)，OR值为0.47(0.26～0.86)，见表3。

表3 肺肿瘤组与对照组CHRNA5基因-1640C/T位点合并基因型频率分布比较

Tab.3 Comparison of combined genotype frequency between NSCLC group and control group

根据肺肿瘤组对象病理类型的不同，将患者进一步分为腺癌和非腺癌组。两组相比发现，腺癌组CT、TT基因型、T等位基因频率均高于非腺癌组，而CC基因型频率、C等位基因频率均低于非腺癌组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 肺肿瘤病理类型与CHRNA5基因-1640C/T多态性的关系

Tab.4 Relationship between pathological type of NSCLC and CHRNA5-1640C/T gene polymorphism

3 讨论

肺部肿瘤目前认为是由遗传和环境因素共同作用造成的多基因疾病，有关全基因组关联研究进展迅速[3]，尼古丁被认为是在肺部肿瘤发生发展过程中重要的因素之一。

尼古丁依赖和成瘾性与人类15号染色体上的尼古丁受体家族(CHRNA3、CHRNA5、CHRNB4)有密切关系[4-6]。尼古丁受体家族是体内编码产生的一类可以与尼古丁结合而发挥其功能的蛋白家族，位于人类15号染色体长臂，与吸烟行为密切相关。肺泡上皮细胞、肺的神经内分泌细胞和肺癌细胞株中也有尼古丁受体蛋白的表达。目前研究表明，该蛋白可与烟草中特有的致癌物结合，上调转录因子NF-KB的表达，促进肿瘤细胞的增殖，增加患肺癌的风险。

近年来，多个研究报道尼古丁受体CHRNA3/5的SNP变化与肺癌的发病相关[7]。

CHRNA3基因启动子区的一个遗传突变位点rs6495309(T>C)，是已被报道的中国人群特有的、分布频率较高的与肺癌相关的遗传位点，与吸烟人群相关，携带C等位基因的吸烟者发生肺癌的风险显著增加。郑霞等[8]报道在CHRNA5 rs503464多态性中，TA携带者患肺癌的风险较TT/AA明显降低(OR=0.642，P<0.001)。结合病理类型风险，TA携带者患肺腺癌和肺鳞癌的发病风险明显低于纯合基因型TT/AA携带者(OR值分别为 0.597 和0.542，P=0.002)。分层分析后显示,这种保护作用在年龄大于60岁及无肿瘤家族史的人群中更显著(P<0. 001)。Wojas等[9]通过研究97名肺癌患者、99名COPD患者及98名健康对照者的rs16969968位点多态性、尼古丁依赖测定等，各组间AA、AG、GG基因型频率无明显差异，但GG基因型可减低尼古丁成瘾性，A等位基因在高度尼古丁依赖者中频率更高。Wang等[10]研究发现从基因相关性的角度来说，吸烟、COPD以及吸烟合并COPD影响肺癌发生的风险分别是18.3%、30.2%、20.6%。同样，通过对靶基因的治疗，也可以减少相关发病风险[11]。

本研究选择观察吸烟人群CHRNA5-1640 C/T(rs3829787)单核苷酸多态性与慢性阻塞性肺疾病易感性的关系。首先，本研究结果证实，在-1640 C/T(rs3829787)处存在CC、CT和TT三种基因型，且每种基因型均具有较高的突变率。肺癌组与对照组相比，CT、TT基因型、T等位基因频率均高于对照组，而CC基因型频率、C等位基因频率均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。上述3种基因型的分布在肺癌组中TT型较对照组明显升高，且基因型频率的相对风险分析发现，CT、TT基因型各自患肺癌的风险分别是CC基因型的1.77倍(95%CI： 0.93～3.36)和4.70倍(95%CI： 1.23～17.99)，提示CHRNA5-1640 C/T多态性与吸烟人群肺癌的发病具有相关性，-1640 T等位基因可能是该人群肺癌发生的遗传因素和易感因子，即随着等位基因T的增加，患肺癌的风险亦随之增加。从基因水平证实了尼古丁参与肺癌的发病机制，解释了吸烟人群发生肺癌的原因。这部分内容与目前研究结果基本一致[12]。

进一步的亚组分析中，肺肿瘤组病例按照病理类型的不同分为腺癌组与非腺癌组。结果发现，腺癌组CT、TT基因型、T等位基因频率均高于非腺癌组，而CC基因型频率、C等位基因频率均低于非腺癌组，差异具有统计学意义(P<0.05)。-1640 T 等位基因可能与肺癌，特别是肺腺癌的发生有着密切的联系。传统理论提示肺非腺癌与吸烟关系密切，与本研究结果有出入，作为基因易感性研究，本研究数据较单薄，故还需要进一步扩大样本量来证实，需要进一步详尽的研究。

综上所述，本研究结果显示出CHRNA5基因-1640处C、T基因在肺癌组和正常对照组之间存在显著性差异，-1640T等位基因可能是吸烟人群罹患肺癌，尤其是肺腺癌的遗传危险因素和易感因子，对具有该位点T等位基因的特定人群，适当干预尼古丁摄入所起到的作用，有待于进一步的前瞻性研究。

[1] Cataldo JK. High-risk older smokers’s perceptions, attitudes, and beliefs about lung cancer screening[J]. Cancer Med, 2016，28(4)： 617.

[2] Benowitz NL： Pharmacology of nicotine： addiction, smoking-induced disease, and therapeutics [J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol， 2009,49： 57-71.

[3] 朱猛,程阳,戴俊程,等.基于全基因组关联研究的中国人群肺癌风险预测模型[J].中华流行病学杂志,2015,36(10)： 1047-1052.

[4] Young RP, Hopkins RJ, Hay BA, et al. Lung cancer gene associated with COPD： Triple whammy or possible confounding effect [J]. Eur Respir,2008,(32)： 1158-1164.

[5] Jane E, Sarginson J, Joel D, et al. Markers in the 15q24 nicotinic receptor subunit gene cluster (CHRNA5-A3-B4) predict severity of nicotine addiction and response to smoking cessation therapy[J]. Am J of Med Gen，2011,1-10.

[6] Benowitz NL： Pharmacology of nicotine： addiction, smoking-induced disease, and therapeutics [J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2009,49： 57-71.

[7] Rabe KF, Hurd S, Anzueto A, et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease： GOLD executive summary[J].Am J Respir Crit Care Med，2007,176(6)： 532-555.

[8] 郑霞,李雪,王一，等.乙酰胆碱受体亚单位α5基因启动子区-10位T/A多态和肺癌易感性的关联分析[J].肿瘤,2010,30 (8)： 691-695.

[9] Wojas-Krawczyk K, Krawczyk P, Biernacka B, et al. The polymorphism of the CHRNA5 gene and the strength of nicotine addiction in lung cancer and COPD patients[J]. Eur J Cancer Prev，2012，21(2)： 111-117.

[10] Wang J, Spitz MR, Amos CI, et al. Method for evaluating multiple mediators： mediating effects of smoking and COPD on the association between the CHRNA5-A3 variant and lung cancer risk[J]. PLoS One,2012,7(10)： e47705.

[11] 张鹏,王永武.肺癌的基因治疗[J].同济大学学报：医学版,2002,23(5)： 425-427.

[12] Zheng X, Duan W, Xu J, et al. Functionally significant nicotine acetylcholine receptor subunit α5 promoter haplotypes are associated with susceptibility to lung cancer in Chinese[J]. Cancer, 2011，15(20)： 4714-4723.

Association between CHRNA5 gene polymorphism and susceptibility to non-small cell lung cancer

(Dept. of Respiratory Medicine， East Hospital， Tongji University， Shanghai 200120， China)

【Abstract】Objective To investigate the association of nicotine acetylcholine receptor subunits alpha 5 (CHRNA5) gene-1640C/T (rs3829787)polymorphism with susceptibility to non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods CHRNA5 gene-1640C/T polymorphism was genotyped with PCR-Sanger method in 102 NSCLC patients and 131 healthy adults. The association of CHRNA5 gene polymorphism with pathological type of lung cancer was analyzed. Results CHRNA5 gene-1640 CT+ TT genotype and T allele were more frequent in NSCLC patients than that in controls (P<0.01). The relative risk of CT genotype carrier to NSCLC was 1.77 times of CC genotype (95%CI： 0.93-3.36). The relative risk of TT genotype carrier to NSCLC was 4.70 times of CC genotype (95%CI： 1.23-17.99). The distribution of CHRNA5 gene-1640T polymorphism in lung adenocarcinoma was higher than that of non-adenocarcinoma. Conclusion CHRNA5 gene-1640T allele may be a genetic susceptibility factor to NSCLC，especially to lung adenocarcinoma.

【Key words】non-small cell lung cancer; nicotine acetylcholine receptor subunits alpha 5 gene; single nucleotide polymorphism; allele

基金项目：同济大学附属东方医院起航计划青年项目(DFQH-Q18)

作者简介：陆晶晶(1984—)，女，主治医师，硕士.E-mail: lujjhf@hotmail.com

烟碱型乙酰胆碱受体基因多态性与NSCLC的相关性研究

1 资料与方法

2 结 果

3 讨 论

2 结果

3 讨论