·基础研究·
王均玲, 余 晨
(同济大学附属同济医院肾脏科，上海 200065)
【摘要】目的 探索线粒体超氧离子
是否参与血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)介导的细胞外基质纤维化。方法 培养大鼠肾脏成纤维细胞(NRK-49F)，AngⅡ刺激24h后进行活细胞线粒体荧光染色(mitosox)以检测细胞内的线粒体
；采用酶标仪和流式细胞术检测线粒体超氧离子含量和分布；利用Real-time PCR、Western blot及免疫荧光检测AngⅡ对细胞外基质胶原蛋白-Ⅰ(collagen-Ⅰ, Col-Ⅰ)、胶原蛋白-Ⅲ(collagen-Ⅲ, Col-Ⅲ)和纤维连接蛋白(fibronectin, FN) 表达的影响；并进一步检测NADPH氧化酶抑制剂罗布麻宁(apocynin， APO)对下游超氧离子合成以及ColⅠ、 ColⅢ和 FN表达的影响。结果 Ang Ⅱ明显促进大鼠肾脏成纤维细胞的生成以及细胞外基质Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN 的表达。Apo可显著抑制AngⅡ所引起的肾成纤维细胞中表达，而AngⅡ诱导的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN 的合成作用亦被APO阻断。结论 线粒体介导了Ang Ⅱ诱导的肾脏成纤维细胞的细胞外基质蛋白的合成，采用APO抑制的表达，可使纤维化程度减轻。
【关键词】肾脏纤维化； 血管紧张素Ⅱ； 活性氧； 超氧离子； NADPH氧化酶抑制剂； 大鼠
肾脏纤维化指在各种致病因素作用下，间质细胞及细胞间质增多，基质蛋白合成增加而降解减少造成细胞外基质(extracellular matrix, ECM)大量堆积导致的肾小球硬化和肾小管间质纤维化[1]。肾脏纤维化的机制目前还不是很清楚，血管紧张素-Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是体内重要的血管活性物质之一，它参与调节细胞的增殖、凋亡以及纤维化进程[2]。以往对于AngⅡ-慢性肾脏疾病的氧化应激研究中，缺乏针对线粒体氧化应激的研究，尤其是AngⅡ 介导的线粒体氧化应激对肾脏纤维化的机制，本研究在大鼠肾脏成纤维细胞中探讨氧化应激与肾脏纤维化之间的相关机制，并验证超氧离子是否介导AngⅡ引起肾脏间质细胞外基质的合成。
NRK-49F细胞，由复旦大学生理与病理教研室赠送。
1.1 主要试剂和仪器
细胞培养液MEM (GIBCO)、FBS(GIBCO)、Apocycin(sigma2501950)，线粒体荧光探针Mito (invitrogen 1252221)， RNA抽提试剂盒(Invitrogen)，RT试剂ReverTra Ace®qPCR RT Kit(TOYOBO)，Realtime PCR反应试剂(TaKaRa)，Col1 抗体(Abcom34710)，Col3抗体(Abcom6310)，Fibronectin 抗体(F3648)二抗(抗IgG-Cy3 Jackson)，PCR引物由上海生工合成，RT试剂ReverTra Ace®qPCR RT Kit(TOYOBO)，Realtime PCR反应试剂(TaKaRa)，酶标仪，BioTek细胞流式仪(accun C6)，显微镜(Nikon)。
1.2 NRK-49F细胞线粒体超氧离子流式检测
将细胞分别传代于5个细胞瓶中，24h后进行分组： 空白组，AngⅡ组(AngⅡ溶度10-6 )，apocynin组(apocynin溶度10-6 ),AngⅡ+apocynin组(溶度叠加)，每组设平行3组，药物干预24h后抽去含有药物的培养液，用可与线粒体特异性的超氧化物反应的荧光试剂Mito invitrogen 1252221 5μm 的工作溶度覆盖细胞，37℃，10min,消化液消化细胞，血清终止消化并收集细胞，1500转/min，离心半径10cm，离心5min，用0.01mol PBS悬浮细胞，上流式仪检测并设阴性对照组。
1.3 Mito荧光酶标检测NRK-49F细胞内线粒体含量
将细胞消化，离心后以每孔5.3×103 的细胞数种植于96孔中，24h后进行分组： 空白组，AngⅡ组(AngⅡ溶度10-6 )，apocynin组(apocynin溶度10-6 ),AngⅡ+apocynin组(溶度叠加)，每组设4复孔，药物干预24h后抽去含有药物的培养液用Mito (invitrogen 1252221)为5μm的工作溶度每孔加入50μl，37℃孵育10min，上酶标仪550波长检测并读取数据。
平均D值(平均吸光度)的计算：
复孔平均D值-空白平均D值 = 每组平均D值
1.4 Mito荧光显示NRK-49F细胞内线粒体分布
细胞消化，离心后将细胞种植于24孔培养板中，24h后进行分组，药物干预24h后抽去含有药物的培养液，用Mito 5μm的工作溶度覆盖细胞，37℃ 孵育10min，荧光显微镜(激发光： 590nm)下观察每组细胞内线粒体分布。
1.5 RT-PCR法检测
采用Trizol一步法抽提细胞RNA, 进行电泳与紫外分析检测，反转录反应严格依照试剂盒说明进行。引物设计如下： RatGAPDH。正向5,AGTGCCAGCCTCGTCTCATAG,下游CGTTGAA-CTTGCCGTGGGTAG；rCollagenⅠAAGGGTCATC-GTGGCTTCTCT，GACCGTTGAGTCCATCTTTGC；rCollagenⅢTCCCAGAACATTACATACCACTGC，TCTCATGGCCTTGCGTGTT；rFN GCTATGGAGG-AAGCAGAGGTTT，ACCAATCTTGTAGGACTGA-CCCC。扩增条件： 94℃变性(30s),56℃退火(30s),72℃延伸(30次循环，继续72℃延伸5min)，使用BIO-RAD(CFX-96)实时定量PCR仪器进行扩增，扩增完成后收集荧光定量数据进行分析，数据包括扩增曲线、工作曲线、融解曲线与相应Ct值等。
1.6 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 NRK-49F细胞
培养24h，药物干预24h后，予以线粒体荧光染色后，酶标仪检测
含量： Ang Ⅱ 刺激组线粒体生成较对照组增加；Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组线粒体水平有显著降低(两者均P<0.05，图1)。
图1 各组超氧离子吸光度比较图
Fig.1 Comparison of superoxides absorbance by enzyme-labelling in different groups
注： AngⅡ组与对照组相比，细胞荧光增强；AngⅡ+APO较AngⅡ组组荧光强度降低(P<0.05)
2.2 NRK-49F细胞
培养24h，药物干预24h后，予以线粒体荧光染色后，流式细胞检测
含量： Ang Ⅱ刺激组线粒体生成较对照组增加，Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组线粒体水平有显著降低，两者均P<0.05(图2)。
图2 流式细胞检测荧光阳性细胞结果比较图
Fig.2 Comparison of fluorescence positive cells detected by flow cytometry in different groups
注： AngⅡ组与对照组相比，阳性细胞数显著增多，AngⅡ+APO较AngⅡ组阳性细胞数显著降低(P<0.05)
2.3 NRK-49F细胞
培养24h，药物干预24h后，Real-time PCR检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN表达： Ang Ⅱ刺激组较对照组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN mRNA表达显著增加；Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN mRNA表达有显著降低(两者均P<0.05，图3a，图3b,图3c)。
4NRK-49F细胞培养24h后，药物干预24h后，免疫荧光法检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN表达： Ang Ⅱ刺激组较对照组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达显著增加，Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达有显著降低，两者均(P<0.05，图4a,4b,4c)。
图3a 荧光定量PCR结果各组中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、FN基因的mRNA相对表达量P<0.05
Fig.3a The relative expression of Collagen-ⅠmRNA in different groups
注： AngⅡ组与对照组相比，Collagen-ⅠmRNA表达有显著增多，AngⅡ+APO较AngⅡ组mRNA表达显著降低(P<0.05)
图3b Col-ⅢmRNA相对表达量
Fig.3b The relative expression of Collagen-Ⅲ mRNA in different groups
注： Ang Ⅱ 组与对照组相比，Collagen-Ⅲ mRNA表达有显著增多，Ang Ⅱ+APO较Ang Ⅱ 组mRNA表达显著降低(P<0.05)
图3c FN的mRNA相对表达量
Fig.3c The relative expression of FN in different groups
注： AngⅡ 组与对照组相比，FN mRNA表达显著增多，AngⅡ+APO较AngⅡ 组mRNA表达显著降低(P<0.05)
图4a 免疫荧光检测Collagen-Ⅰ蛋白
Fig.4a Immunofluorescence staining of Collagen-Ⅰ protein
注： Ang Ⅱ刺激组较对照组，Collagen-Ⅰ表达显著增加，Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组Collagen-Ⅰ蛋白表达有显著降低(P<0.05)
图4b 免疫荧光检测Col-Ⅲ 蛋白
Fig.4b Immunofluorescence staining of Col-Ⅲ protein
注： Ang Ⅱ刺激组较对照组Col-Ⅲ表达显著增加，Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组Col-Ⅲ蛋白表达有显著降低(P<0.05)
图4c 免疫荧光检测FN蛋白
Fig.4c Immunofluorescence staining of FN protein
注： AngⅡ刺激组较对照组FN表达显著增加，Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组FN蛋白表达有显著降低(P<0.05)
5NRK-49F细胞培养24h，药物干预24h后，western blot 检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN蛋白表达。Ang Ⅱ刺激组较对照组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达显著增加；Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达有显著降低(两者均P<0.05，图5)。
2.4 流式细胞检测线粒体超氧离子结果
Ang Ⅱ刺激组较对照组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达显著增加；Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达有显著降低(两者均P<0.05，图5)。
图5 各组的WB蛋白水平图
Fig.5 The collagen Ⅰ, Ⅲ and fibronectin levels in different groups
线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所，ADP和无机磷酸通过电子传递链的氧化磷酸化转变为ATP，这一过程同时伴随着NADPH或FADH2通过电子传递体传递给分子氧的呼吸作用，ROS也不断产生。机体在正常状态也存在反应抑制体系。ROS产生过多与清除减少会导致ROS蓄积，产生氧化应激，引起体内分子、细胞、机体损伤。既往研究提示： Ang Ⅱ 与血管紧张素-Ⅰ型受体(AT1-R)结合，激活 NADPH氧化酶，产生ROS，促使氧化应激反应程度增强[3]。氧化应激产生的ROS的种类，有超氧自由基
过氧化氢(H2O2)、氢氧自由基(-OH)，单线态分子氧(O1/2)、过氧化脂类(LOOH)等。90%ROS 由线粒体产生，是ROS的最主要的成分，也是最早产生的氧自由基。NADPH氧化酶是调控超氧自由基
的主要氧化酶，NADPH 氧化酶的抑制剂有二苯基碘(DPI)和夹竹桃素(apocynin， APO)等，抑制其活性后，下游的 ROS 的生成降低[4]。
Cabello-Verrugio等在骨骼肌细胞中发现Ang Ⅱ，Col Ⅲ和FN升高，APO有抑制作用[5]。本研究利用线粒体的可与特异的荧光发生氧化反应，其产物与核酸结合后，荧光信号可被显微镜检测到这一特性，特异性检测线粒体活性氧含量。本研究结果显示： 酶标仪检测荧光D，与对照组相比，在AngⅡ作用下，肾脏成纤维细胞线粒体活性氧增加，Ang Ⅱ+Apo联合使用组较AngⅡ组生成下降，说明APO可抑制Ang Ⅱ引起的升高，与已有的研究结果类似[6]。流式细胞的检测结果亦提示AngⅡ刺激组较对照组显著增加，Ang Ⅱ+Apo组较Ang Ⅱ组显著下降。本研究的结果： Col Ⅰ、Col Ⅲ和mRNA水平，蛋白水平(免疫水平检测，WB检测)结果均显示Ang Ⅱ组相对于对照组表达量升高，给予Apo抑制后Col Ⅰ, Col Ⅲ和FN较Ang Ⅱ组有明显下降。本研究结果提示，肾脏成纤维细胞中，Ang Ⅱ促进线粒体生成，Apo抑制线粒体生成，这一变化与Col Ⅰ, Col Ⅲ和FN的表达水平一致。因此推测线粒体超氧离子可能介导了肾脏纤维化的过程。这一结果的具体机制以及氧化应激引起机体损伤的其他机制有待于进一步的研究。
【参考文献】
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Mitochondria superoxides mediates angiontension Ⅱ-induced synthesis of extracelluar matrix
WANG Jun-ling， YU Chen
(Dept. of Nephrology, Tongji Hospital, Tongji University， Shanghai 200065, China)
【Abstract】Objective To investigate the effects of mitochondria superoxides on synthesis of extracelluar matrix induced by angiontensionⅡ(Ang Ⅱ) in NRK-49F cells. Methods Cultured rat renal fibroblast NRK-49F cells were stimulated with AngⅡand/or apocynin (APO) for 24h, then stained with mitochondrial mitosox fluorescence method, the contents and distribution of mitochondrial was detected by enzyme-labeling method and flow cytometry. The mRNA and protein levels of collagen Ⅰ, Ⅲ and fibronectin were detected by Real time PCR, immunofluorescence and Western blot, respectively. Results Compared with the control group, AngⅡincreased the level of in NRK-49F mitochondria. In AngⅡ+APO group significantly decreased compared with AngⅡ group, which was consistent with the results of flow cytometry and enzyme-labeling measurement. Compared with the control group，mRNA level of collagen Ⅰ, Ⅲ and fibronectin in AngⅡ group was increased significantly; while that in AngⅡ + APO group decreased compared with AngⅡ group. The collagen Ⅰ, Ⅲ, and fibronectin protein expression in AngⅡ group was significantly increased, compared with control group; while that in AngⅡ+APO group was decreased compared with AngⅡ group. Conclusion Mitochondria superoxide may mediate the AngⅡ-induced matrix protein synthesis in rat renal fibroblast NRK-49F cells.
【Key words】renal fibrosis； angiotensin Ⅱ； reactive oxygen； superoxides； NADPH oxidase inhibitors； rat
doi：10.16118/j.1008-0392.2016.03.003
收稿日期：2015-09-24
基金项目：国家自然科学基金(NSFC 81370790)
作者简介：王均玲(1982—)，女，住院医师，硕士研究生.E-mail: 852775856@qq.com
通信作者：余 晨.E-mail: yuchen@tongji.edu.cn
【中图分类号】R 551
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2016)03-0016-05