·基础研究·

As2O3诱导NB4、HL-60细胞凋亡的机制研究

张雪莲1，周尊海1，张利强3，王博1，贾玉芳4，梁爱斌2

(1. 同济大学附属杨浦医院内分泌科，上海 200090； 2. 同济大学附属同济医院血液科，上海 200065； 3. 上海赛金生物医药有限公司，上海 201203； 4. 济宁市第一人民医院妇产科，山东济宁 272011)

【摘要】目的探讨三氧化二砷(As2O3)在体外抑制急性早幼粒白血病(acute promyelocyticleukemia， APL)细胞NB4、HL-60细胞增殖，诱导细胞凋亡的分子机制。方法通过WST-8法检测上述两个细胞株的增殖抑制曲线;用AnnexinV/PI流式细胞术检测细胞的凋亡;用Real time PCR检测凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、p53、C-myc、Survivin在As2O3处理前后的表达变化，同时用Westernblot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、P53在As2O3处理前后的表达变化。结果 As2O3能够显著抑制两种细胞增殖, Westernblot检测及Realtime PCR结果显示，As2O3处理引起了两种细胞中Bax、Caspase-3、Caspase-8 、Caspase-9基因表达水平增加，且蛋白表达水平上都出现了活性形式的Caspases。NB4细胞中Survivin、C-myc、Bcl-2的基因表达水平都显著降低，突变型p53蛋白在细胞内的量同样显著下降；HL-60细胞的C-myc表达水平显著降低，但Survivin、Bcl-2表达水平无明显变化。结论 As2O3能在药物临床浓度范围内有效抑制急性早幼粒白血病细胞HL-60、NB4的细胞增殖, 但方式不同；1.5μmol/L浓度的As2O3对NB4细胞生长的抑制体现在诱导细胞分化并诱导细胞凋亡，对HL-60细胞生长的抑制只体现在诱导细胞分化。HL-60细胞中高表达的Survivin、Bcl-2抑制了细胞的凋亡。NB4、HL-60细胞株中P53基因的细胞遗传学变异的不同可能是As2O3对这两种细胞增殖抑制机制差异的主要原因之一。

【关键词】As2O3；细胞凋亡； NB4； HL-60； survivin； p53

20世纪70年代，国内医务工作者最早发现As2O3对(acute promyelocytideukmia, APL)有显著疗效。此后国内学者研究发现As2O3对急性早幼粒细胞白血病的治愈率达到了90%。国外学者发现As2O3可以诱导早幼粒细胞白血病细胞分化和凋亡[1]。 NB4细胞在低浓度条件下，As2O3诱导细胞趋向分化，而在高浓度条件下，As2O3诱导细胞趋向凋亡[2]。在PML-RARa融合蛋白阴性的HL-60细胞中，同样表现出低浓度As2O3诱导细胞分化，高浓度As2O3诱导凋亡的现象[3]，但诱导凋亡所需的浓度大幅度高于NB4细胞。陈赛娟等发现了As2O3诱导NB4细胞系分化与凋亡的分子机制[4]，揭示了NB4细胞中的PML-RARa融合蛋白是As2O3的靶蛋白。但在PML-RARa融合蛋白阴性的HL-60细胞中，深入探讨As2O3诱导凋亡的研究较少，为此本研究对比研究了在药理浓度条件下As2O3诱导NB4和HL-60细胞分化与凋亡过程中的区别，探讨其分子机制的异同，以期为As2O3临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂

HL-60和NB4细胞系由上海交通大学医学院附属瑞金医院引进。As2O3购自哈尔滨伊达药业有限公司；RPMI 1640、IMDM培养基及FBS购自Gibco公司；Cell Counting Kit-8购自同仁化学研究所；Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I购自BD公司；BCA蛋白定量分析试剂盒、Chemiluminescent HRP Substrate购自Thermo公司；RNAsimple总RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；Power SYBR Green PCR Master Mix购自Applied Biosystems公司。

1.2 细胞培养

NB4、HL-60细胞用含有5%FBS的RPMI 1640培养液常规培养，细胞密度保持在(1×105～5×105)/ml。取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 WST-8法测定细胞增殖抑制率

取细胞密度为1×105/ml的对数生长期细胞，按不同给药方式将上述三个细胞系各分8组，其中6组为实验组(As)：加入As2O3后使各组终浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0μmol/L；1组为对照组(Ac)：不含药物只含细胞的培养基；1组为空白组(Ab)：不含细胞和药物的培养基。培养48h后，每孔加入CCK-8 10μl，继续培养3～5h后，测定波长450nm处的D。根据如下公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。

1.4 流式细胞术分析细胞凋亡

取细胞密度为1×105/ml的细胞。每个细胞系分为两组：未加药的对照组和加入终浓度为1.5μmol/L As2O3的实验组。常规培养24、48、72h 后将细胞离心、洗涤，加入AnnexinⅤ及PI染色，用流式细胞术检测细胞凋亡。

1.5 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达

收集药物处理24h、48h、72h的实验组和对照组细胞，提取RNA,并反转录成cDNA。实时荧光定量PCR在ABI Prism 7500系统上扩增目的基因。引物序列见表1。以β-actin为内参，应用相对定量法(2-ΔΔCt)进行定量分析。

表1 引物序列

Tab.1 Sequences of primers

1.6 Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达

收取药物处理后细胞，提取细胞总蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度，煮沸变性。经SDS-PAGE，之后转膜，脱脂奶粉封闭1h，并一抗4℃孵育过夜，二抗孵育，经ECL化学发光法检测蛋白的表达，Image QuantTM LAS 4000凝胶图像分析系统扫描分析结果。

1.7 统计学处理

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。不同时间点基因表达与对照组间比较采用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 As2O3对HL-60 、NB4细胞增殖抑制

两细胞株在不同浓度As2O3处理48h条件时的增殖抑制率结果经统计学分析，两株细胞系之间的增殖抑制率有显著差异(P<0.05，n=5)。从As2O3浓度-细胞增殖抑制率关系图(图1)可得知，NB4对As2O3的细胞增殖抑制敏感性与HL-60接近，但略高。利用Grahpad Prism 5软件计算得到NB4、HL-60的IC50值分别为1.3μmol/L、2.1μmol/L。

2.2 As2O3处理各细胞系的凋亡情况

以1.5μmol/L的As2O3处理细胞，在不同时间(24h、48h、72h)用AnnexinV-FITC/PI流式细胞术检测细胞的凋亡情况。结果显示，随着处理时间的增加，在NB4中凋亡细胞比例迅速上升，由24h的5.43%上升到48h的52.56%,72h的70.67%，见图2 A-D。而HL-60凋亡细胞数量并未随着As2O3处理时间的延长而明显增加，只是从对照的1.38%增加到 72h 的2.38%，见图2 E～H。可以看出NB4细胞对1.5μmol/L 的As2O3诱导细胞凋亡的敏感度强，而HL60对1.5μmol/L 的As2O3诱导的细胞凋亡具有抵抗性。

图1 不同浓度As2O3对细胞的增殖抑制率(n=5)
Fig.1 Effect of As2O3 on inhibition rate of cell proliferation in NB4 and HL60 cells

图2 A-D、E-H分别表示HL60、NB4细胞系control、24h、48h、72h的细胞流式检测结果
Fig.2 The result of Flow cytometric with Annexin-V/PI staining

2.3 As2O3处理过程中各细胞株的凋亡相关基因的表达情况

1.5μmol/L As2O3作用于NB4、HL-60后，两个细胞株在细胞增殖抑制率接近的情况下，出现细胞凋亡率差距显著的现象。为了探究这一现象背后分子机制的异同，检测了1.5μmol/L As2O3处理后，两种细胞中Caspase3、Caspase8、Caspase9、Bcl-2、Bax及Survivin、C-myc、CD11b等基因表达的变化趋势，也考察了NB4细胞中的突变型p53基因的表达变化。同时也分析了各基因在不同细胞中的相对表达情况。

As2O3处理前后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bcl-2、Survivin基因在HL-60细胞株中mRNA表达水平明显高于NB4，是NB4细胞的mRNA表达水平的2～8倍。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因在药物处理后各基因表达水平增长趋势及幅度较为接近，见图3A、B、C。在对As2O3诱导凋亡敏感的NB4细胞株中，Survivin基因的mRNA表达水平在药物处理的24h时就显著下降；Bcl-2基因的mRNA表达水平在药物处理的24h时也已明显下降，见图4D；在对As2O3诱导凋亡不敏感的HL60细胞株中，Bcl-2基因的mRNA表达水平在药物处理的72h内下降不明显，见图3D，Survivin基因的mRNA表达水平在药物处理48h后才明显下降，见图4D。

As2O3处理前后HL-60细胞中Bax基因表达无显著上升，但NB4细胞中Bax基因在药物处理后其mRNA 表达水平上升趋势快、增加幅度大，见图3E。

Bcl-2/Bax值(mRNA表达水平比值)在两细胞系中表达水平有着明显的差异P<0.01，见图3中F所示，Bcl-2/ Bax表达水平的比值在NB4中下降趋势显著，24h后即迅速下降，由未处理时的4.47下降到药物处理48h时的0.86。在NB4细胞株中Bcl-2/Bax值接近1的时间与细胞出现大量凋亡的时间基本一致。HL-60细胞株中的Bcl-2/ Bax表达水平的比值在药物处理前后一直在6.71～8.48之间波动，下降趋势不明显，Bcl-2基因的表达量一直显著大于Bax。

药物处理后，NB4细胞、HL-60细胞中的C-myc的基因表达水平急剧下降，处理24h的表达量与未处理前相比分别下降了60.5%和47.9%；两者细胞中C-myc的基因表达水平下降幅度与其对As As2O3的增殖抑制敏感度强弱呈正相关(r=0.7582)。

在As2O3诱导下NB4细胞中p53基因表达量稍有增加，而P53缺失的HL60细胞中则检测不到p53基因的表达，见图4C。

图3 As2O3处理NB4、HL60细胞不同时间对Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax及C-myc等基因表达的影响
Fig.3 Effect of As2O3 on mRNA expression of Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, Bcl-2, Bax and C-myc in NB4 and HL60 cells
A、B、C、D、E分别表示As2O3处理前后，各细胞株中caspase3/8/9、Bcl-2、Bax基因表达变化情况；F表示As2O3处理前后，各细胞株中Bcl-2与Bax基因表达水平比值的变化情况；误差棒表示标准偏差(s)，n=3；*P<0.05； **P<0.01

图4 As2O3处理NB4、HL60细胞不同时间C-myc、CD11b、p53及Survivin等基因表达的变化
Fig.4 Effect of As2O3 on the mRNA expression of C-myc、CD11b、P53 and Survivin in NB4 and HL60
误差棒表示标准偏差(s)，n=3,*P<0.05； ** P<0.01

2.4 As2O3处理过程中各细胞系的凋亡相关蛋白的表达情况

NB4细胞在As2O3处理12h时，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9已经都出现裂解带，并且随着As2O3处理时间的延长，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的前体蛋白表达量呈不断增加的趋势，其活性形式的蛋白量也明显增加。Bax蛋白表达量也表现出了随着As2O3处理时间的延长而上升的趋势,Bcl-2则表现出相反的趋势(图5)。这说明NB4细胞内，在蛋白水平上Bcl-2/ Bax比值也是不断下降的,与基因表达比值变化趋势一致。

HL-60细胞在As2O3处理12h时，Caspase-3、Caspase-8出现了裂解带，而Caspase-9直到72h时才出现裂解带。随着As2O3处理时间的延长，Caspase3、Caspase8、Caspase9的前体蛋白表达量呈不断增加的趋势，但其活性形式的蛋白表达量没有明显的增加。Bax蛋白表达量也表现出了随着As2O3处理时间的延长而略上升的趋势(图5)，但Bcl-2蛋白表达量下降的趋势不明显。

NB4细胞中突变型P53蛋白在As2O3诱导 12h 后表达量即明显下降，24h后急剧下降，48h后细胞内的突变型P53蛋白已检测不到(图5)，与此同时细胞出现大量凋亡现象(图2C)。HL60细胞中则始终检测不到突变型P53蛋白(图5)。

图5 Western blot法检测各细胞系的凋亡相关蛋白的表达
Fig.5 Effect of As2O3 on expression of apoptosis-related protein in NB4 and HL60 cells detected by Western blotting

3 讨论

As2O3通过促进细胞分化、抑制细胞增生、促进细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成等多种途径发挥抗肿瘤作用[5]。

已有的研究表明, C-myc作为一种原癌蛋白,有推进细胞周期、促使细胞转化、抑制细胞分化的作用[6]。CDllb是髓系细胞分化的重要标志，在髓系细胞逐渐分化成熟过程中的表达会逐渐升高[7]。在本研究中，As2O3处理后HL-60的CDllb基因表达水平不断上升，C-myc基因表达水平不断下降，表明在1.5μmol/L的As2O3浓度处理72h内，HL-60趋向于分化，细胞增殖被抑制。NB4在As2O3处理后CD11b基因的表达水平先小幅度上升，48h后细胞出现大量凋亡，同时细胞CD11b表达量下降。而在此过程中C-myc基因表达水平不断下降。表明在1.5μmol/L As2O3浓度处理后，NB4细胞经历了分化过程后又趋向凋亡，从而细胞增殖被抑制。

正如As2O3对NB4细胞表现出的诱导凋亡作用一样，As2O3抗肿瘤的作用还表现在促进肿瘤细胞凋亡。细胞的凋亡主要通过两条途径进行一条为死亡受体途径，亦称外源性途径；另一条途径称为线粒体途径，亦称内源性途径。已有的一些研究表明As2O3可以直接抑制癌细胞生长,激活Caspase-8或者Caspase-9、Caspase-3 等机制诱导凋亡[8]。

As2O3处理后，两株细胞的Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9在基因及蛋白水平的表达上都显示出了上升的趋势。在Western blot检测中，4～12h内 Caspases-3、Caspases-8在两株细胞中都出现了活性形式，且NB4中Caspase-9也出现了活性形式,并且随着时间的延长而增加。而在HL-60细胞中，Caspase-9的活性形式在72h时才出现，显著晚于 NB4。Caspase-8、Caspase-9活性形式的出现说明在我们所选用的药物浓度条件下，As2O3可以诱导两株细胞凋亡信号激活，并最终激活了细胞凋亡的执行者caspase-3。在这两株细胞中，细胞凋亡的死亡受体途径中的起始因子Caspase-8和线粒体途径中的起始因子Caspase-9在As2O3处理后都出现了基因及蛋白水平的表达增强，表明这两条凋亡途径都被激活。

细胞凋亡结果表明，NB4细胞在As2O3处理24h、48h、72h后，早中期细胞凋亡率与对照组相比分别显著增加，见图2A-D；HL-60细胞在同样的时间点上细胞凋亡率与对照组相比无明显变化，见图2E-H。说明这两株细胞对As2O3诱导的凋亡敏感度有显著区别，NB4对As2O3诱导凋亡高度敏感，而HL60对As2O3诱导凋亡则是耐受的。

HL-60和NB4相比较，在对As2O3细胞增殖生长抑制敏感度方面接近，但在As2O3诱导的凋亡敏感度方面，NB4显著敏感于HL-60。并且，HL-60在As2O3处理后凋亡通路被激活却没有明显的凋亡现象。为了解释这些现象，检测了凋亡抑制基因Bcl-2及凋亡促进基因Bax在基因及蛋白水平的表达情况及凋亡抑制基因Survivin在基因水平的表达情况。

Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡的线粒体途径中起着非常重要的作用, 它们通过维持抗凋亡、促凋亡成员的平衡来维持线粒体膜的完整性[9],细胞中单独的Bcl-2表达水平的下降或Bax表达水平的上升并不能决定细胞是否凋亡，而Bcl-2/Bax比值的降低则表明细胞走向凋亡[10-11]。Survivin蛋白是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。研究发现Survivin基因可以直接抑制Caspase-3和 Caspase-7的活性，从而阻断细胞的凋亡过程[12]。研究结果显示在两株细胞中其Survivin基因为高表达，说明与文献报道的造血系统肿瘤经常存在Survivin过度表达情况一致[13]。

As2O3处理NB4细胞后，与Survivin基因和Bcl-2基因表达快速下调。Survivin基因表达的下调解除了对线粒体中细胞色素C释放及Caspase-3 活性的的抑制,消除了凋亡抑制环节；同时NB4细胞中Bcl-2表达下降，且Bcl-2/bax比值下降，意味着线粒体膜通透增加，有利于细胞色素C的释放，促进凋亡信号的传递[14]，在NB4细胞中，As2O3从抑制Survivin基因表达和上调Bcl-2/bax比值两个方面，解除抑制凋亡因素，促进凋亡信号沿着线粒体途径向下传递。这是NB4细胞出现细胞凋亡的重要原因。而在HL-60细胞中，Bcl-2表达量是NB4中表达量的4～9倍，并且随着As2O3处理时间增加而上调；同时Bcl-2/bax比值也在As2O3处理过程中没有明显的变化，表明线粒体途径在在As2O3处理过程仍然被高表达的Bcl-2抑制；表达量未明显下降的Survivin同样是抑制HL-60细胞中线粒体途径的重要因素。HL-60细胞株中Caspases-9活性形式的出现较晚，也可以证实该细胞中线粒体途径被抑制。HL-60细胞中，Caspase-3、Caspase-8在12h时就出现了活性形式，而Caspases-9活性形式的出现较晚，说明HL-60细胞在As2O3诱导12h内死亡受体途径最先激活，并且由此途径激活了Caspase3,而线粒体途径在As2O3诱导72h后才被激活。虽然 12h 后HL60细胞中就出现了活性形式的Caspase3，但由于Survivin基因表达未显著下降，细胞内的Survivin蛋白抑制了Caspase3的活性，使得凋亡信号的向下传导被阻断，所以HL-60并没有走向凋亡。这些研究结果提示：在NB4细胞中，As2O3通过线粒体途径和死亡受体途径有效地诱导凋亡细胞凋亡；而在HL-60细胞中，Bcl-2及Survivin不能被As2O3有效地抑制，线粒体途径的激活被显著延滞，通过死亡受体途径产生的活性形式的Caspase3也被Survivin抑制了活性，导致了HL60细胞凋亡的抑制。

两种细胞在p53基因的细胞遗传学变异上有显著的区别[15]，NB4细胞中存在野生型p53基因的突变，HL60细胞中p53基因缺失，NB4细胞中有突变型p53基因及蛋白的表达，HL60细胞中则没有p53基因及蛋白的表达，并且这两种细胞都存在Survivin基因的过度表达[16]。Survivin与p53在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用，两者之间的关系密切，通过直接相互作用及p2l-Rb-E2F信号通路等相互作用。有研究表明野生型p53在体内可与Survivin启动子结合，从而抑制Survivin基因的转录和蛋白的表达及p53基因的突变，由于显性负效应作用，突变型P53蛋白抑制了野生型p53蛋白的功能，丧失了对Survivin基因转录的抑制作用，从而可以使Suvivin基因的异常高表达[17-18]。

As2O3处理后，NB4细胞中p53基因的表达量没有明显变化,见图4C，但突变型P53蛋白在细胞内的水平呈现出显著的下降,见图5。说明As2O3降低了突变型P53蛋白对野生型P53正常生理功能的抑制。已有的研究证实As2O3通过破坏PML及PML-NBs降解PML/RARa，从而保护P53正常的生理功能[19]。Joe等研究结果也显示，在NB4细胞中As2O3通过P53途径诱导细胞凋亡[20]。据此可推断出As2O3诱导后,NB4细胞中野生型P53的功能得到恢复，有效抑制了Survivin基因的表达，从而解除了Survivin对细胞凋亡的抑制,使NB4细胞最终走向凋亡。HL60细胞中直接抑制Survivin基因表达的p53基因缺失，造成As2O3不能通过p53信号通路直接抑制Survivin基因表达，所以，HL-60细胞在As2O3诱导后Survivin基因下调不显著。由于As2O3诱导HL-60走向分化的同时也显著下调C-myc基因表达，所以HL-60细胞增殖被显著抑制[21]。但高表达的Survivin基因制仍然继续抑制细胞凋亡途径。这可能是NB4和HL60细胞对As2O3的细胞增殖抑制率相近，而对Al2O3诱导的细胞凋亡率差异显著的原因之一。

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Mechanisms of arsenic trioxide-induced apoptosis in NB4 and HL60 cells

ZHANG Xue-lian1， ZHOU Zun-hai1， ZHANG Li-qiang3, WANG Bo1， JIA Yu-fang4， LIANG Ai-bin2

(1. Dept. of Endocrinology， Yangpu Hospital, Tongji University， Shanghai 200090， China； 2. Dept. of Hematology， Tongji Hospital, Tongji University， Shanghai 200065， China； 3. Shanghai Cellgene bio Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201203, China； 4. Dept. of Gynecology， Jining First People’s Hospital， Jining 272011, Shandong Province, China)

【Abstract】Objective To investigate the mechanism of arsenic trioxide (As2O3) -induced apoptosis in acute promyelocytic leukemia(APL)NB4 and HL60 cells．Methods NB4 and HL60 cells were treated with As2O3 at different concentrations. Cell proliferation was determined by WST-8 assay. The apoptosis rate was detected by flow cytometry with annexinV-FITC/PI double staining．The mRNA expression of apoptosis-related genes caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, Bcl-2,Bax, the proto-oncogene C-myc, survivin, p53 and granulocytes differentiation antigen CD11b was detected by RT-PCR. The expression of apoptosis-related proteins caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, Bcl-2，Bax was determined by Western blotting. Results Arsenic trioxide proliferation of NB4 and HL60 cells with similar sensitivity. As2O3 induced apoptosis of NB4 cells, but induced HL-60 differentiation to mature stage. Western blot detection and RT-PCR results showed that As2O3 treatment caused up-regulation of Bax, caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, CD11b mRNA levels, and protein levels of caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 in both cell lines. The expression of survivin, C-myc, Bcl-2 and mutated p53 in NB4 cells treated with As2O3 significantly decreased. The expression of C-myc in HL60 cells treated with As2O3 significantly decreased, but survivin and Bcl-2 expression levels were not changed. Conclusion Arsenic trioxide can effectively inhibit proliferation of NB4 and HL60 cells, and induce apoptosis of NB4 cells, while induce HL-60 differentiation to mature stage. These effects may be associated with the altered expression of survivin, Bcl-2 and mutated p53 genes.

【Key words】arsenic trioxide; cell apoptosis; NB4； HL-60; survivin; p53

doi：10.16118/j.1008-0392.2016.03.002

收稿日期：2015-09-12

基金项目：国家自然科学基金(81270615)；上海市卫生局科研基金(20134470)

作者简介：张雪莲(1979—)，女，主治医师，硕士.E-mail: 13761219860@163.com

通信作者：梁爱斌.E-mail： 1ab7182@tongji.edu.cn

【中图分类号】R 551

【文献标志码】A

【文章编号】1008-0392(2016)03-0008-08