发病机制中的研究进展·综 述·
发病机制中的研究进展田香珠1， 林盈盈1 综述， 葛宇星2 审校
(同济大学附属第十人民医院神经内科，上海 200072)
【摘要】ClC-2是一种电压门控氯通道，在稳定细胞膜电位、调节细胞兴奋性方面有重要意义。但其在癫
发病机制中所起的作用仍不清楚。本研究就ClC-2的各项研究进展，包括ClC-2的结构与功能、ClC-2在癫动物模型中的改变以及在癫患者中ClC-2基因表达异常与癫发病的相关性进行综述。
【关键词】ClC-2； 癫； 突触后抑制
氯离子是一种广泛存在于生物体内的阴离子，主要通过跨膜转运和(或)离子通道等方式来调控生物体的各种生理功能。ClC-2是电压门控氯通道的一种亚型。研究表明ClC-2与心脏电活动、睾丸和视网膜变性、脑白质病变等疾病的发病有关。有学者发现： ClC-2是由超极化激活的内向整流氯离子通道，它参与了GABAA受体(GABAARs)介导的突触后抑制效应[1]。近年来，突触外GABAA受体(extra-synaptic GABAARs)介导的紧张性突触后抑制(tonic inhibition)参与癫
的发病已得到广泛关注[2]，而位于突触上GABAARs(synaptic GABAARs)介导的时相性突触后抑制(phasic inhitibion)亦依赖于细胞内低氯的环境。氯离子在维持细胞正常电生理功能方面具有不可忽视的作用。关于ClC-2在癫发病机制中所起的作用仍不甚明确。本研究就ClC-2的结构或功能变异是否可以引起癫作如下综述。
由ClCN2基因编码的ClC-2蛋白，是由907个氨基酸组成，分子量为99000，与ClC-0，ClC-1通道蛋白有50%的同源性[3]。目前，人体ClC-2高分辨率的三维结构仍不明确，但是，可以从其他有关ClC型氯通道研究中得到启示。Weinreich等[4]提出，ClC-2是类似二聚体的结构，Mindell等[5]用冷冻电镜术对大肠杆菌进行分析得到CIC型氯通道是同源二聚体结构。Dutzler等[6]从沙门鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌提出2个原核ClC氯通道的X-射线结构，证明其是双孔二聚体的通道。
ClC-2包括快、慢两个通道，它们有着不同的门控特性与电压依赖性。ClC-2还具有负反馈调节因子： SPAK(SPS1相关脯氨酸-丙氨酸激酶)和OSR1(氧化应激反应蛋白激酶1)，它们可以抑制Cl-通道，阻止Cl-离子外流，调节细胞体积变化[7]。此外，ClC-2羧基末端还有两个胱硫醚-β-合成酶(CBS1和CBS2)区域，三磷酸腺苷(ATP)和其他核苷酸都与之绑定。CBS区域主要由β-α-β-β-α的二级结构模式构成，折叠成一个球状的三级结构，其中包括三个反向平行的β折叠和两个α螺旋。ClC-2羧基末端的主要作用为调节门控通道[3]。
ClC-2电压门控通道在静息状态下是关闭的，只有在超极化的时候(-40～140mV)被激活，例如，抑制GABAergic后，[Cl-]i增加。活化后，恢复正电位时产生一个非常缓慢的电流，门控通道呈现接近于零的最低开放。ClC-2的开放需要通过超极化来去除外部Cl-结合位点内的羧酸基团。ClC-2包括快、慢两个通道，快通道主要受细胞外氯离子浓度的影响，慢通道则受各种生理条件影响，如膜电位、氯离子、pH、温度及ATP等，同时，慢通道的开启也能够促进快通道的开放。ClC-2作为一个强大的内向整流电导，宏观层面上，氯电流显示缓慢激活过程，即使脉冲>50s也不会衰变。当外部的pH值降至6.5时，氯电流增强，抑制进一步酸化。类似的功能已经在非洲爪蟾卵母细胞和哺乳动物细胞中观察到。ClC-2羧基末端可以减缓通道激活时间，切除或修改羧基末端可加速门控通道激活、失活时间，证明了其稳定神经元兴奋性作用。
ClC-2在神经元和神经胶质细胞中均有表达。在神经元中，ClC-2通过介导氯离子内流和影响神经元的兴奋性输入电阻来直接控制兴奋性，ClC-2提供的流出通道维持GABAA受体的突触抑制。而Ratté等[8]提出，不同于原先减少Cl-内流、增加Cl-跨膜梯度来促进GABAAR介导的突触抑制，在生理条件下，ClC-2通道通过泄漏Cl-，直接降低神经元的兴奋性。近期有学者发现，在秀丽隐杆线虫内，ClC-2的同源基因clh-3，可以通过调节其特定的神经元活动兴奋性，从而控制产卵行为。clh-3功能上调，抑制兴奋，抑制产卵；功能下调，促进兴奋，促进产卵。有趣的是，clh-3通道并不受GABAA受体介导，而是通过细胞内低氯环境直接抑制其兴奋性。这种机制有利于神经元氯离子内流守恒[9]。在神经胶质细胞，ClC-2的缺失可以造成GlialCAM和MLC1的损失，从而导致脑白质变性。这可能是GlialCAM作为ClC-2通道的辅助亚基，调节其靶向细胞与细胞间的路口，并修改其功能特性。有报道： cereblon和GlialCAM是ClC-2的两个不同亚基，其改变可以影响ClC-2的门控配置[10-11]，而美沙酮可以抑制ClC-2[12]。
有人在氯化锂-匹罗卡品大鼠模型当中发现： ClC-2蛋白表达量在癫急性发作期无明显变化，而在慢性期表达明显减少[13]。随后，又有研究发现： 致后，尤其是进入慢性期的大鼠，海马CA1区ClC-2的蛋白表达量明显上调，且具有功能性；而慢性颞叶癫大鼠海马CA1区α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制电流显著增大[14]。表明了ClC-2与癫发病密切相关。最新一项实验，用基因敲除小鼠研究发现，在神经元Cl-超载后，ClC-2不仅有助于快速排出细胞内Cl-，还有助于增大背景电导(通过改变输入电阻)，从而影响神经元的兴奋性。在CLCN2-/-小鼠中，观察到fEPSP I/O曲线明显降低，锥体细胞的兴奋性受到抑制，从而防止CLCN2-/-小鼠癫发作[15]。
ClCN2基因突变已被确定与特发性癫的发病有关。Sander等[16]发现CLCN2基因突变与IGEs的发病存在相关性。D’Agostino D等[17]对112例家族性癫患者(包括两个具有全面发作性癫儿子和无症状的父亲，和患有局灶性癫的父子)用18种常见的多态性检测，分析得出ClCN2基因突变可导致家族性癫。证实了ClC-2突变是癫发生的易感因素[18]。Haug等[19]对3个无亲缘关系的IGEs家系进行研究时发现ClCN2有3种不同的突变体： 过早终止密码子(M200fsx231)、非典型剪接(de174-117)、单个氨基酸置换(G715E)，并认为前两者导致了ClC-2通道功能的丧失，降低了GABAergic抑制作用所必需的氯离子浓度梯度；后者则改变了氯离子的流动方向，使GABAAR开放后产生氯离子外流，细胞膜去极化。Saint-Martin等[20]筛选了52个来自IGE家族的无关患者和23例Dosse综合征的患者。在三个无关的IgE的家庭，确定了两个新的错义突变： p.arg235gln和p.arg577gln，和一个新的p.arg644cys变异。
但在ClCN2基因敲除的动物中，却没有发现KO小鼠有样发作的行为学改变。Blanz等[21]表明，ClC-2基因敲除并不降低癫发作阈值，神经功能缺损也比较轻微。他们还从大量的人类DNA和电生理分析测序得出： 之前在癫患者身上发现的ClC-2序列异常，有可能是无害的基因多态性。Klassen等[22]通过功能性SNP的严重程度和不同个体之间nsSNP通道变化的模式，揭示了特发性癫患者离子通道基因的复杂变异谱(IPE)，提出癫患者的基因结构的变异亦会出现在其他健康人上，而前者通常携带一个以上的基因突变。Flody等[23]认为未出现样行为可能是氯离子浓度的动态调节的变化，而Cortez等[24]也认为ClC-2的表达可能在海马中起着潜移默化的神经保护作用。
近年来，大量实验数据拓展了人们对ClC-2的认识，然而，ClC-2的基础研究和临床疾病发病机制之间的联系还没有确立，二者间甚至存在矛盾。目前，ClC-2与癫的发病相关性仍不确切，只能说它们有可能增加癫发作的易感性，是癫发病的危险因素。因此，在未来的研究中将不断确定ClC-2的生理病理作用及其与癫的关系，以推动新的抗癫药物的研究，改善癫患者的生活质量。
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Research progress of ClC-2 in pathogenesis of epilepsy
TIAN Xiang-zhu1， LIN Ying-ying1， GE Yu-xing2
(Dept. of Neurology， Tenth People’s Hospital， Shanghai 200072， China)
【Abstract】ClC-2 is a member of the supergene family of voltage-gated chloride channels. It is proved to be inwardly rectifying， and plays an important role in setting the intracellular chloride concentration in neurons expressing inhibitory GABAA receptors. The role of ClC-2 in epilepsy is still not clear. Here， we review the structures and functions of ClC-2 and changes of ClC-2 in experimental epileptic models. This article try to analyze the correlation between ClC-2 and epilepsy.
【Key words】ClC-2； epilepsy； postsynaptic inhibition
doi：10.16118/j.1008-0392.2016.02.027
收稿日期：2015-04-22
基金项目：国家自然科学基金青年项目(81301104)
作者简介：田香珠(1988—)，女，硕士研究生.E-mail： dxtxzdxtxz@163.com
通信作者：葛宇星.E-mail： yuxingge2009@gmail.com
【中图分类号】R 741
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2016)02-0118-04