表1 两种方法的检测率比较
Tab.1 Comparison of drug resistant detection rate between liquid culture and the linear probe method
检测方法RFP耐药敏感INH耐药敏感MDR例数%液体法1730036281154.7HAIN2329437280185.7P值0.200.930.44
·临床研究·
【摘要】目的 评估线性探针技术快速检测耐多药结核分枝杆菌的效果。方法 选取317例结核分枝杆菌分离株分别进行MGIT960液体药物敏感性试验和线性探针快速检测，以液体法作为金标准，探讨线性探针检测技术的敏感性和特异性以及Kappa值。结果 317株结核分枝杆菌复合群样本分别进行MGIT960液体药物敏感性试验和线性探针快速检测，其中液体法利福平(RFP)耐药率为5.5%，异烟肼耐药率为11.5%，耐多药(MDR)患者检出率为4.7%；线性探针快速检测法利福平(RFP)耐药率为7.4%，异烟肼耐药率为11.7%，MDR检出率为5.7%。以液体法为金标准，线性探针检测技术检测利福平和异烟肼的敏感性和特异性分别为94.3%、97.7%和86.3%、98.0%。结论 线性探针检测技术是一个敏感、特异和快速的诊断MDR的有效方法。
【关键词】线性探针； 结核分枝杆菌； 耐多药； 快速诊断
耐药结核病，尤其是耐多药(Mycobacterium， MDR)结核病的出现给全球结核病控制带来了严重的挑战[1-2]。耐多药结核病是指至少同时对利福平(RFP)和异烟肼(INH)二种抗结核药物耐药。我国耐药结核病控制形势十分严峻，第五次流调显示我国总耐多药率为6.8%，广泛耐药率2.1%[3]，在假设活动性肺结核患者的耐多药率与菌阳肺结核患者的耐多药率相同的条件下，总耐多药率虽然下降了3.9个百分点，但仍高于全球的平均水平[4-5]。控制耐药结核病特别是耐多药和广泛耐药结核病的流行是目前结核病防制工作中亟待解决的问题。
传统的耐药结核分枝杆菌的诊断依赖于药物敏感试验。近年来，随着技术的进步，出现了大量先进的检测手段，在敏感性、特异性、检测周期方面皆优于传统方法。基于核酸扩增的分子生物学技术为临床耐药结核分枝杆菌的快速检测打开了一个广阔的前景。已知结核分枝杆菌的耐药性主要是由发生在特定基因组区域的碱基突变引起的，这些区域包括药物的靶点基因和(或)催化前体药物为活性药物的基因。临床菌株中约95%的利福平耐药菌株是由rpoB基因上81bp的耐药决定区突变所致；近90%的异烟肼耐药结核分枝杆菌携带发生在katG基因、inhA或ahpC启动子区域的碱基突变。本研究对结核分枝杆菌分离株分别进行液体法药物敏感性试验与线性探针快速检测技术，以液体法为金标准，评估线性探针快速检测技术在临床中检测耐多药结核分枝杆菌的效果。
1.1 材料
1.1.1 标本来源 选取同济大学附属肺科医院2013年间收治的结核病患者分枝杆菌分离培养阳性菌株。H37Rv标准株(ATCC27294)由中国疾病预防控制中心结核病参比实验室提供。
1.1.2 试剂与仪器 GeneTypeMTBDRplusver 1.0与全自动核酸印迹微生物检测系统GT-Blot 48均购自梅里埃诊断产品(上海)有限公司。MGIT960全自动分枝杆菌鉴定系统购自BD医疗器械(上海)有限公司。PCR仪为BIO-BAD品牌，由美国伯乐生命科学公司生产。结核分枝杆菌抗原检测(胶体金法)试剂盒购自杭州创新生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 菌型初筛 从阳性培养管中吸取待测样本100μl滴到检测板的样本下部，15min后观察检测板的判定部，检测线(T)及质控线(C)双方都确认出现紫红色条带为阳性，即结核分枝杆菌复合群；检测线(T)处没有出现紫红色条带，只是在质控线(C)出现紫红色条带为阴性，即非结核分枝杆菌。
1.2.2 核酸提取 在生物安全柜中取300μl无菌去离子水加入1.5ml带螺帽的离心管内，取一菌环L-J培养基上生长良好的菌体悬于去离子水中； 80℃ 水浴灭菌30min；12000r/min,离心半径10cm，弃上清；加入200μl去离子水，旋涡混匀；95℃水浴中孵育20min；超声裂解15min；12000r/min,离心半径10cm，将上清液转移至新的离心管中，-20℃保存备用。
1.2.3 PCR反应体系 每个PCR管中加入PNM 35μl，10x PCR缓冲液5μl，MgCl22μl，Taq酶 0.2μl，去离子水3μl， 5ul模板DNA。
1.2.4 PCR扩增 15min 95℃1个循环；30s 95℃、2min 58℃；25s 95℃、40s 53℃、40s 70℃ 20个循环；8min 70℃ 1个循环。
1.2.5 全自动核酸印迹微生物检测系统GT-Blot 48杂交显色。
1.3 统计分析
统计分析均采用Stata 11.0软件(Stata/SE 11.0版本，Stata Corporation， College Station，Texas，USA)计算。不同方法检测结核分枝杆菌结果的比较采用配对检验，P<0．05为差异具有统计学意义。两种方法检测一致性比较采用Kappa检验， Kappa≥ 0．7说明两种方法的一致性较好； 0．4≤Kappa<0.7说明两种方法的一致性一般； Kappa<0．4说明两种方法一致性差。
2.1 348株分枝杆菌液体培养阳性菌株
经结核分枝杆菌抗原检测(胶体金法)试剂盒检测，其中317株为结核分枝杆菌复合群，31株为非结核分枝杆菌。
2.2 317株结核分枝杆菌复合群样本
分别进行MGIT960液体药物敏感性试验和线性探针快速检测，其中液体法利福平(RFP)耐药率为5.5%，异烟肼耐药率为11.5%，耐多药(MDR)患者检出率为4.7%；线性探针快速检测法利福平(RFP)耐药率为7.4%，异烟肼耐药率为11.7%，MDR检出率为5.7%(表1)。经过统计学分析，两种方法的RFP耐药率、INH耐药率及MDR检出率P值均>0.05，统计无显著性差异。
表1 两种方法的检测率比较
Tab.1 Comparison of drug resistant detection rate between liquid culture and the linear probe method
检测方法RFP耐药敏感INH耐药敏感MDR例数%液体法1730036281154.7HAIN2329437280185.7P值0.200.930.44
2.3 317株结核分枝杆菌复合群两种方法
RFP的检测一致性为97.5%，INH的检测一致性为96.7%。以液体法作为金标准，线性探针检测技术RFP的敏感性为94.3%，特异性为97.7%，P<0.001；INH的敏感度为86.3%，特异度为98.0%，P<0.001；其中RFP与INH的Kappa检验结果分别为0.83与0.79,均大于0．7，说明两种方法的一致性较好。
2.4 液体法与线性探针法不一致的菌株
共16株进行线性探针法重复性检测，其中利福平的检测结果与原始结果完全一致，重复性为100%；异烟肼有2株与原始结果不一致，重复性为87.5%。
我国结核病实验室常用的药物敏感性试验检测方法主要有固体检测法与液体检测法，其中固体检测法包括比例法和绝对浓度法，液体法是WHO在“全球结核病耐药监测项目”中推荐的统一方法。固体检测法一般检测周期为4周，结核分枝杆菌生长缓慢的特性给临床的诊断治疗以及传染病防疫工作带来了很大的困难[6]，而液体法检测成本较高且需要昂贵的仪器设备支持。为了快速诊断耐药结核病对于及时有效地指导临床用药，提高治疗效果，有效控制耐药结核病的传播具有重要地意义。随着对耐药结核分枝杆菌耐药机制研究的不断深入，使利用检测菌株特定基因突变预测耐药表型成为可能[7]，从而有望实现耐药菌株的快速鉴定。
线性探针快速检测技术(Geno Type MTBD-Rplus)试剂盒基于核酸杂交技术，用于检测MTB耐药特定基因rpoB的81bp核心区域、katG315密码子和inhA启动子基因突变，预测利福平和(或)异烟肼耐药表型。该方法操作简单，可以在一个工作日内完成耐药性检测，极大缩短了药物敏感性报告时间。
李强等对197例临床结核菌分离株进行传统比例法药物敏感性试验和MTBDR-Plus检测RFP敏感度88．6%、特异度98．8%，INH敏感度79．3%，特异度98．8%；菅记涌等[8]报道的耐RFP敏感度96．3%，耐INH敏感度85．3%；黄玉平等[9]对河南省459例涂阳肺结核患者痰标本应用线性探针技术快速检测耐利福平、耐异烟肼菌株检测，同时进行传统罗氏培养和药敏试验结果相比较，两种方法检测耐利福平的灵敏度为82．8%，耐异烟肼的灵敏度为80．4%，耐利福平、异烟肼特异度均为99．3%。本研究运用MGIT960液体药物敏感性试验检测耐多药(MDR)结核患者的检出率为4.7%，线性探针快速检测法MDR检出率为5.7%，两者无统计学差异。这两种方法检测一致性也较好，RFP的一致性为97.5%，INH的检测一致性为96.7%。以液体法作为金标准，线性探针检测技术RFP的敏感性为94.3%，特异性为97.7%，；INH的敏感度为86.3%，特异度为98.0%。与上述文献相比，本研究RFP与INH的敏感度略高，而特异度略低，分析其原因可能为以下几种： (1) 药敏试验方法不同，本研究采用的是MGIT960液体法而以上研究采用的是固体法；(2) 试验标本不同有关，本研究采用的是临床分离株，而河南省的研究采用的是患者痰标本直接检测；(3) 样本数量不同，本研究样本数远多于上述研究。
将液体法与线性探针法不一致的菌株进行线性探针法重复性检测，其中利福平的重复性为100%，异烟肼的重复性为87.9%，与以往报道的文献结果不同[10],这可能与样本的选择以及样本数量有关。
MTBDR-Plus方法的敏感性高，特异性强，结果解释也比较容易，通过与标准条带比对可以用肉眼直接判读结果。该技术操作周期短，使结核病患者特别是耐多药结核患者尽早得到合理治疗，在缩短其传播时间、提高治愈率、减轻疾病负担、保护健康人群和控制结核病疫情等方面具有重大意义，具有较好的临床应用前景。
但是该方法属于基因扩增试验，开展此项目的实验室需符合《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》要求，有4个独立且完全隔离的工作区域，包括试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区以及产物分析区，并取得卫生部或省临床检验中心颁发的“临床基因扩增检验实验室技术验收合格证书”，这为MTBDR-Plus方法的普及带来了一定的局限性。每一种新的诊断技术在应用前，都需考虑其成本效益。李强等[11]将线性探针技术与传统药敏试验检测耐药结核病的成本进行比较，发现传统药敏检测每例患者平均成本为365．8元，用线性探针检测每例患者的平均成本为201．0元，线性探针法较传统药敏试验节省164．8元，平均成本降低约45．05%，差异具有统计学意义。
总之，线性探针检测技术(MTBDR-Plus)敏感、特异、快速且成本适中，适合在临床实验室开展应用。
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Effect evaluation of Mycobacterium tuberculosis using linear probe technique
【Abstract】Objective To evaluate the application of linear probe technology for rapid detection of multidrug-resistantMycobacterium tuberculosis(MDR-TB) isolates. Methods Three hundred seve-nteen Mycobacterium tuberculosis isolates were tested for drug susceptibility by using MGIT 960 liquid method and linear probes technique. With liquid method as gold standard, the sensitivity, specificity and the Kappa value of linear probing method for detection of MDR-TB was evaluated. Result Both MGIT 960 drug susceptibility tests and linear probe detection were performed for a total of 317 Mycobacterium tuberculosis isolates. The MGIT 960 tests showed that the resistant rate to Rifampicin was 5.5%, Isoniazid was 11.5% and the rate of MDR-TB was 4.7%; while linear probe detection showed the resistance rate to Rifampicin was 7.4%, to Isoniazid was 11.7% and the rate of MDR-TB was 5.7%. With MGIT 960 method as golden standard, the sensitivities of linear probe method for detection of resistance to Rifampicin and Isoniazid were 94.3%, 97.7% and the specifici-ties were 86.3% and 98%, respectively. Conclusion Linear probe technique is a rapid and effective method for detection of MDR-TB.
【Key words】linear probe technology；Mycobacterium tuberculosis； multidrug-resistant；rapid diagnosis
doi：10.16118/j.1008-0392.2015.06.022
收稿日期：2015-02-27
【中图分类号】R 521
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2015)06-0108-04