自发性糖尿病大鼠肾脏微血管密度的实验研究

(1. 上海交通大学附属第六人民医院超声医学科，上海 201306； 2. 同济大学附属第十人民医院超声科，上海 200072； 3. 新乡医学院临床医学，河南新乡 453003)

【摘要】目的观察自发性糖尿病大鼠(Goto-Kakisaki Rats， GK)肾脏微血管在糖尿病的不同发展时期的变化规律，为糖尿病肾病的血流灌注研究提供实验基础。方法选取雄性GK大鼠和Wistar大鼠各30只，每种按周龄分组(4、12、20周各10只)。肾脏标本常规石蜡包埋切片后，用免疫组化法染色。每只肾脏标本取切片5张，每张切片皮质区、髓质区各随机观察18个视野。采用图像分析系统定量分析微血管密度。每张切片随机选取5个肾小球，采用不规则方式分割，分析其周长、面积、毛细血管密度。结果 (1) GK各周龄组髓质微血管密度均小于对照组(P<0.05～P<0.01)，GK组间有差异(P<0.01)。(2) GK 20周龄组肾小球微血管密度明显小于同周龄Wistar组(P<0.01)。GK组间、对照组间均存在差异(P<0.01～P<0.05)。(3) GK4周龄组肾小球平均周长明显大于同周龄Wistar(P=0.01)。不同周龄Wistar组间亦有差异(P<0.01～P<0.05)。结论 GK大鼠存在肾微血管稀少的现象，有可能是糖尿病的继发性改变之一；低周龄GK大鼠肾髓质微血管稀少可能与遗传有关。

本研究应用计算机图像分析技术定量分析不同周龄GK大鼠肾脏微血管密度，观察糖尿病肾损害是否普遍存在肾微血管数量改变、变化规律及糖尿病发生与发展的关系，旨在为糖尿病肾病的血流灌注研究提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

GK雄性大鼠30只，按周龄分为3组，4、12、20周龄各10只，体质量分别为82～98g；245～295g；和336～388g。选择东京Wistar雄性大鼠30只作为对照组，亦按周龄分为3组： 4周龄10只，体质量83～101g；12周龄10只，体质量277～304g；20周龄10只，体质量303～333.5g。

日本Olympus公司双目光学显微镜，型号BX51；美国Motic公司Motic BA400显微镜和Motic Images Advanced 3.2型图像分析仪。

将处死后的实验大鼠切开皮肤并分离肌肉层，快速取出肾脏，除去肾包膜及脂肪囊，置天平上称体质量。随即在冰生理盐水中洗涤并用锋利刀片纵行剖开，获取肾脏最大冠状剖面，用滤纸吸去表面水分，置10%中性福尔马林溶液中固定24h。常规石蜡切片，片厚4μm，免疫组化染色。

1.4 微血管密度的测量

采用图像分析仪对实验大鼠肾脏皮质区和髓质区微血管密度分别进行定量分析。每只大鼠的肾脏标本选5张切片，每张切片随机采集皮质区、髓质区各18个视野。双目显微镜放大倍数为10×20，采集所有显影的毛细血管图像。所有选区采用统一的面积、光强，全自动分割方式。计算单位面积内微血管的面积密度(微血管总面积/选区面积×100%)。此外，每张切片皮质区随机选取5个较大的肾小球，分割方式为不规则分割法，分析肾小球毛细血管密度和周长。

测量数据的表示方式为

各周龄组与对照组(Wistar)用t检验进行比较，组间比较用方差分析，采用SPSS 11.5统计学软件进行处理，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏微血管的特点

各组肾脏标本组织切片中毛细血管均呈现为棕黄色，显色均匀(图1)。

2.2 皮质间质微血管密度的分析结果

GK各周龄组与同周龄Wistar比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。Wistar组间差异无统计学意义(P>0.05)。GK组间差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3 髓质微血管密度的分析结果

GK各周龄组髓质微血管密度均小于同周龄Wistar组(P<0.05～P<0.01)，GK组间有差异(P<0.01)，Wistar组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4 肾小球微血管密度的分析结果

GK12周龄组肾小球微血管密度均值较同周龄Wistar组增大，但无统计学意义(P>0.05)。GK20周龄组肾小球微血管密度小于同周龄Wistar组(P<0.01)。GK、Wistar均存在组间差异(P<0.01～P<0.05)，见表3。

2.5 肾小球周长的分析结果

GK 4周龄组的肾小球平均周长较同周龄Wistar组增大(P=0.01)。GK12周龄组、GK20周龄组与其同周龄Wistar组差异无统计学意义(P>0.05)。GK组间、Wistar组间差异均有统计学意义(P<0.01～P<0.05)，见表4。

3 讨论

糖尿病是由多种病因引起以慢性高血糖为特征的代谢紊乱。目前，我国每日新增糖尿病患者约3000余例，每年大约增加120万例。糖尿病不但威胁着人类的健康，也成为各国尤其是发展中国家巨大的医疗负担。糖尿病肾病已经成为2型糖尿病中最常见、最严重的微血管病变并发症之一。据调查，我国糖尿病患者合并肾损害的比例高达64%。有研究表明，糖尿病肾病进展至肾功能衰竭的速度约是其他肾脏疾病的14倍[1]。糖尿病导致的身体机能发生的各种代谢异常，使得糖尿病肾病的微血管病变从早期的可逆的功能性改变[2-7]，逐渐发展成为不可逆的病理性改变，最终导致患者致残、致死[8]。因此，如能在糖尿病肾病的微血管发生不可逆改变前发现其数量、形态、功能的改变，进行干预，阻止微血管进一步损害，对于糖尿病肾病的防治有着重要意义。本实验通过对比GK大鼠及Wistar大鼠的肾脏微血管密度的增龄性变化规律及其与糖尿病病程发展的相互关系，为糖尿病肾病的血流灌注研究提供实验基础。

4周龄GK大鼠肾小球周长明显大于同周龄对照组，之后便没有显著差别，可见肾小球增大是早期就发生的。有学者研究了糖尿病db/db小鼠，认为其肾小球增大的主要原因是肾小球内微血管长度及系膜细胞的数量有所增加，基底膜增厚[12]。对早期STZ糖尿病小鼠的研究也发现，肾小球毛细血管数量明显增多，其中主要是新生的毛细血管，并伴有血管内皮生长因子VEGF的增多。梁纲等研究了实验性2型糖尿病(T2DM)鼠，发现肾小球细胞增多，引起体积增大。本实验发现12周龄GK大鼠的肾小球微血管密度虽较同龄对照组增大，但无统计学意义，推测肾小球增大可能与肾小球细胞增生或微血管重构有关。

国外有学者研究了糖尿病Zucker大鼠，发现其8周龄时，肾脏皮、髓质的微血管密度均增加，而22周时减少。本实验发现各周龄GK大鼠的肾髓质微血管密度及20周龄GK大鼠的肾小球微血管密度均较同龄对照组减少，且都有统计学意义。GK大鼠在早期肾小球增大后出现肾脏微血管减少。SANTLL等通过长期观察发现，年轻的糖尿病患者的血清VEGF浓度越高，肾脏损害越大。VEGF可增加微血管通透性，引起血浆蛋白外渗，形成纤维蛋白，造成血管内皮细胞损伤，系膜细胞增生、肿胀，肾小球毛细血管壁硬化，基底膜增厚，使得糖尿病早期就发生肾脏微血管重构。高血糖导致亦能导致血小板功能活性升高，组织缺血缺氧引起微循环障碍，进一步损伤糖尿病肾脏微血管，使微血管数量减少。

综上所述，肾小球增大的主要原因可能与肾小球细胞增生或微血管重构有关。糖尿病肾病导致的肾脏微血管数量减少的现象，可能与血清VEGF的浓度有关，具体原因尚不清楚，还需进一步研究。

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GUO Qing-zhi1， DANG Yuan-yuan2， LI Wei-mei1， JIANG Yi-min1， MA Fang1， FENG Yin-ping3

(1. Dept. of Ultrasonography， Shanghai Sixth People’s Hospital， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 201306， China； 2. Dept. of Ultrasonography， Tenth People’s Hospital， Tongji University， Shanghai 200072， China； 3. Xinxiang Medical College Clinical Medicine， Xinxiang Henan Province 453003， China)

【Abstract】Objective To investigate the variation of renal microvascular density in spontaneous diabetic Goto-Kakisaki(GK) rats and its association with the development and progression of type 2 diabetes mellitus. Methods Thirty male GK rats aged 4， 12 and 20 weeks(n=10 in each age group) were used in the study; and 30 Wistar rats of same ages(n=10 in each group) served as control group. The kidney specimens were stained by immunohistochemical method after embedded sections of paraffin. A minimum of 18 fields per slide and 5 slides per group were randomly taken， quantitative analysis of microvessel density in cortex and medulla of kidney specimens were performed by image analysis system. Five glomeruli were randomly selected in each slide and the circumference， area and capillary density of glomeruli were measured. Results The microvessel density of the medulla in all age groups of GK rats was lower than that in control group(P<0.05)， and there was a significant difference among different age groups of GK rats(P<0.01). The glomerular microvessel density in GK rats at age of 20 weeks was significantly lower than that of the same age group of Wistar rats(P<0.01). The average circumference of glomeruli in DK rats at age of 20 weeks was significantly larger than that of the same age Wistar control rats(P=0.01). There were also differences among different age groups of Wistar rats. Conclusions The reduced renal microvascular density in GK rats might be secondary diabetes mellitus， however， the reduced renal medulla microvascular density in young age GK rats may be of genetic feature.

作者简介：郭庆之(1983—)，女，住院医师，硕士研究生.E-mail： eye_190814@sina.com

自发性糖尿病大鼠肾脏微血管密度的实验研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

2 结果

3 讨论