图1 紫草素的分子结构
Fig.1 Molecular structure of Shikonin
·基础研究·
【摘要】目的 研究紫草素(shikonin， SK)诱导肺腺癌A549细胞凋亡及其作用机制。方法 不同浓度紫草素作用于肺腺癌A549细胞后，CCK-8法检测细胞的增殖情况；DAPI荧光染色法和FCM检测细胞凋亡；Western blotting检测紫草素处理48h后Bax、Bcl-2、p-Akt、p-ERK1/2的蛋白水平。结果 紫草素显著抑制肺腺癌A549细胞的增殖活性(P<0.05)，诱导细胞凋亡，与空白对照组比较，紫草素处理组Bax表达上调(P<0.05)，Bcl-2、p-Akt、P-ERK1/2表达下调(P<0.05)。结论 紫草素可以显著抑制肺腺癌A549细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与线粒体凋亡途径，PI3K/Akt信号通路和ERK 1/2信号通路有关。
【关键词】紫草素； 非小细胞肺肿瘤； 细胞凋亡； PI3K/Akt信号通路； ERK 1/2信号通路
紫草素是从紫草科植物紫草的根部提取得到的一种萘醌类化合物。据报道，紫草素具有解毒，抗炎，抗菌和抗肿瘤作用，早在公元5世纪，就被应用于药物治疗。研究证实，紫草素可以通过抑制肿瘤细胞增殖，改变细胞周期，并诱导细胞凋亡等途径，对多种肿瘤细胞产生作用[1-2]。本研究选用人肺腺癌A549细胞系，观察紫草素对A549细胞增殖、凋亡的影响，并对其相关机制进行初步探讨，为紫草素用于肺癌的临床治疗奠定理论基础，同时也为开发利用中药资源提供实验依据。
1.1 细胞与试剂
1.1.1 细胞培养体系 人肺腺癌细胞系A549来自于同济大学附属东方医院转化医学平台，用含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM(高糖)培养液(Gibco)于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，每2～3天换液一次，实验用细胞均处于对数生长期。
1.1.2 药物及试剂 紫草素(Shikonin)为Sigma产品，其化学结构如图1所示；DAPI(Sigm a)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Becton Dickinson)；Bcl-2(#2876S)、Bax(#2774S)，phospho-Akt(Ser473)(#9271S)、phospho-ERK 1/2(#9101)，β-actin(#5125s)、HRP标记的羊抗兔IgG抗体(#7074P2)均购自美国Cell Signaling Technology公司。
图1 紫草素的分子结构
Fig.1 Molecular structure of Shikonin
1.2 实验方法
1.2.1 紫草素溶液配制及实验分组 称取粉末状紫草素3.5mg，按DMSO： Medium=1∶9进行溶解，配制成1.2mmol/L的药物母液，之后进行稀释，使药物浓度分别为1.5、3.0、6.0、12.0和24.0μmol/L，抽滤灭菌，4℃避光保存。试验所应用的药物浓度及药物作用时间均为前期预实验筛选所得的最佳用药浓度和用药时间。
1.2.2 CCK-8法检测紫草素对人肺腺癌A549细胞增殖的影响 取对数生长期A549细胞，按4×103/孔接种于96孔培养板。实验设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量培养基)及实验组(紫草素终浓度分别为1.5μmol/L、3.0μmol/L、6.0μmol/L、12.0μmol/L和24.0μmol/L)，每组设5个复孔。分别于培养12h、24h、48h、72h后加入10μl CCK-8溶液，于37℃培养箱继续培养2h后全自动酶联免疫测定仪490nm处测定各孔吸光度D值。以对照组细胞活性为参照，计算各处理组细胞活性。以药物浓度为横坐标，细胞活性为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
1.2.3 DAPI染色法检测紫草素对人肺腺癌A549细胞形态变化的影响 取对数生长期A549细胞，按1×105/孔接种于含有盖玻片(10%多聚赖氨酸包被)的6孔板内。不同浓度紫草素处理48h后，4%多聚甲醛固定30min，3% BSA封闭30min，1μg/ml DAPI溶液避光染色30min，PBS洗涤，倒置荧光显微镜下观察细胞形态并拍照。
1.2.4 FCM法检测紫草素对人肺腺癌A549细胞凋亡率的影响 取对数生长期A549细胞，按1×105/孔接种于6孔板内。培养24h后，予不同浓度紫草素浓度处理，48h后0.25%胰酶消化(不含EDTA)，100μl Annexin V binding buffer(1X)重悬，再加入Annexin V-FITC和PI染色液各5μl，混匀，室温避光15min，上机前再加入400μl Annexin V binding buffer(1X)混匀，流式细胞仪检测细胞凋亡，FACS Diva软件分析细胞凋亡分布情况。
1.2.5 Western blotting检测紫草素对人肺腺癌A549细胞中凋亡相关蛋白表达量的影响 人肺癌A549细胞经紫草素(1.5μmol/L、3.0μmol/L、6.0μmol/L、12.0μmol/L和24.0μmol/L)作用48h后，加入RIPA细胞裂解液100μl，细胞刮刀刮下细胞，冰浴30min。4℃条件下12000×g离心20min(r=5cm)，离心半径10cm，收集上r/min清液，按照BCA法测定蛋白质浓度。取各样品等量总蛋白100μg，加入等体积的5x上样缓冲液，混匀，煮沸变性10min，在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶上进行电泳，然后转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1h，一抗(p-Akt 1∶1000；p-ERK 1∶1000；Bax 1∶1000；Bcl-2 1∶500；β-actin 1∶5000)4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶5000)室温孵育1h，ECL化学发光显色剂显色，BIO-Rad凝胶成像仪曝光。
1.3 统计学分析
采用SPSS 20.0统计学软件对实验数据进行统计学分析。所有实验均重复3次以上，计量资料以
表示。多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 紫草素抑制肺腺癌A549细胞的增殖
CCK-8法检测结果(图2)显示，紫草素能够明显抑制肺腺癌A549细胞的增殖，并且随着作用浓度和作用时间的增加，紫草素对A549细胞的抑制作用逐渐增强，呈现浓度和时间依赖性。各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。
2.2 紫草素诱导肺腺癌A549细胞凋亡
紫草素(3.0μmol/L和12.0μmol/L)作用于A549细胞48h后，细胞数量明显减少，胞体变圆，缩小，即出现明显的细胞凋亡现象(图3A)。经DAPI染色后，可见紫草素处理组细胞核破裂，固缩，染色质凝集(图3B)。同时用流式细胞仪检测细胞凋亡比率，结果显示，随着紫草素浓度的增加，细胞凋亡比率逐渐增高。实验组A549细胞的总凋亡率(早期凋亡率和晚期凋亡率)分别为13.78%、37.78%、55.90%、68.10%和69.40%，显著高于对照组6.71%(图4)。
图2 CCK-8法检测紫草素对肺腺癌A549细胞增殖的影响
Fig.2 Effect ofdifferent concentrations of SK on viability of A549 cells detected by CCK-8 assay
图3 荧光显微镜下观察不同浓度紫草素作用后肺腺癌A549细胞的形态变化
Fig.3 Effect of different concentrations of SK on morphology and DNA condensation of A549 cells
图4 FCM法检测不同浓度紫草素作用后肺腺癌A549细胞的凋亡率变化
Fig.4 Effects of different concentrations of SK on the apoptosis of A549 cells detected by flow cytometry
2.3 紫草素影响肺腺癌A549细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平
Bcl-2蛋白家族是主要的细胞凋亡调控因子。在线粒体上，Bcl-2家族蛋白通过与其他凋亡蛋白的协同作用，调控线粒体结构与功能的稳定性，发挥着细胞凋亡“主开关”的作用。Western blotting(图5)显示，与空白对照组相比，紫草素处理组Bcl-2表达下调，Bax表达上调，，Bax/Bcl-2明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
图5 蛋白质印迹法检测不同浓度紫草素作用后肺腺癌A549细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达水平
Fig.5 The expression levels of Bax and Bcl-2 proteins in A549 cells treated with SK detected by Western blotting
2.4 紫草素影响肺腺癌A549细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达水平
PI3K/Akt通路广泛存在细胞中，是参与细胞生长、增殖、分化调节的信号转导通路。PI3K/Akt信号通路，有“抗凋亡途径”之称，该信号转导通路的异常，可导致细胞异常增殖引起肿瘤，被认为是癌细胞存活的首要通路。Western blotting结果(图6)显示，与空白对照组相比，紫草素处理组p-Akt表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
2.5 紫草素影响肺腺癌A549细胞中ERK 1/2信号通路相关蛋白的表达水平
ERK是MAPK家族成员之一，参与细胞的增殖、转录、分化及凋亡，是细胞信号传导的重要途径。Western blotting结果(图6)显示，与空白对照组相比，紫草素处理组p-ERK1/2表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
图6 蛋白质印迹法检测不同浓度紫草素作用后肺腺癌A549细胞中P-ERK和P-Akt蛋白的表达水平
Fig.6 The expression levels of P-ERK and P-Akt proteins in A549 cells treated with SK detected by Western blotting
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。据WHO统计显示，2012年全球新增肺癌患病例数约为180万，约有159万患者死于肺癌，位居癌症相关死亡的首位。在中国，肺癌病死率已超过癌症死因的20%，且其发病率和死亡率仍呈逐年上升趋势[5]。非小细胞肺癌(the non-small cell lung cancer， NSCLC)是肺癌的主要表现形式，约占肺癌的80%～85%，包括腺癌，鳞癌和大细胞癌[3-4]。
手术、放疗和化疗仍然是现阶段治疗肺癌的主要手段。尽管基于多年的分子学研究结果而诞生的分子靶向治疗把肺癌治疗模式提高了一个崭新的高度，但肺癌的防治效果仍然达不到根本的改观，在美国，肺癌患者的5年生存率低于15.9%，在中国则更低[4-5]。因此，人们迫切寻求一种疗效高，不良反应少的新型治疗方法。
为了寻求新的治疗手段，补充和替代医学(complementary and alternative medicine， CAM)将关注焦点转移到中医疗法[6]。已有研究证实，部分中医药与顺铂联合应用后，能够有效缓解晚期非小细胞肺癌患者症状，减少不良反应，提高疗效，改善病人生活质量。
紫草素是从紫草科植物紫草的根部提取得到的一种萘醌类化合物，研究发现，其对乳腺癌、肝癌、胃癌等多种肿瘤细胞均有抑制作用[7-8]。本实验研究结果显示，紫草素对肺腺癌A549细胞具有明显的增殖抑制作用。小剂量紫草素作用后，A549细胞的凋亡率约为13.78%，大剂量紫草素作用后的细胞凋亡率可达69.4%，周黎明等临床观察发现，紫草素增加小鼠肝癌和Lewis肺癌放射治疗效应，对正常细胞毒副作用小[9]。综上所述，紫草素对肺癌的治疗具有高效、低毒的特性，具有良好的应用前景。
本研究结果表明，紫草素处理A549细胞后，胞体变圆，缩小，核破裂，染色质凝集，表现为典型的凋亡形态改变。细胞凋亡信号转导通路主要包括线粒体凋亡途径、死亡受体凋亡途径以及非依赖caspase凋亡途径。已有研究证实，紫草素及其衍生物可通过多种机制诱导细胞凋亡。Chang等研究证实，紫草素通过刺激活性氧的产生，活化ERK信号通路，调节BcL-2蛋白，最终诱导骨肉瘤143B细胞的凋亡[10]。本研究从与线粒体密切相关的Bcl-2家族蛋白入手，对紫草素诱导肺腺癌A549细胞凋亡的机制进行了初步研究。结果显示，紫草素作用A549细胞后，Bcl-2蛋白表达下调，Bax表达上调，且随着药物浓度的增加，作用效果更加明显。推测紫草素诱导A549细胞凋亡的机制可能与线粒体凋亡途径有关。
PI3K/Akt信号通路广泛存在细胞中，具有调节细胞的生长、增殖和分化等功能，PI3K/Akt信号通路上调抗凋亡基因的表达，抑制cmyc诱导的细胞凋亡，有“抗凋亡途径”之称，该信号转导通路的异常，可导致细胞异常增殖引起肿瘤，被认为是癌细胞存活的首要通路[11]。Akt是PI3K/AKt通路的直接下游靶点，可通过直接磷酸化多种转录因子如NF-κB和哺乳类动物雷帕霉素(the mammalian target of rapamycin， mTOR)等参与调节多种生命活动过程[11]。本研究发现，紫草素可剂量依赖性地抑制P-AKt的表达，表明紫草素可能通过抑制PI3K/AKt信号通路的传导诱导A549细胞的凋亡。
ERK是MAPK家族成员之一，能将多种细胞外信号(如生长因子)传递至细胞核内，参与细胞的增殖、转录、分化及凋亡，是细胞信号传导的重要途径[12]。已有研究显示，ERK1/2通路可以通过抑制Bad和Bim的活性以及促进Bcl-2抑制细胞凋亡。本实验研究发现，紫草素可剂量依赖性地抑制P-ERK1/2的表达，表明紫草素可能通过抑制ERK1/2信号通路诱导A549细胞的凋亡。
化疗仍是当代治疗肺癌的主要手段，但化疗所带来的诸如受体耐药，细胞毒性等问题，迫使人们寻求新的治疗手段。众多研究者将焦点投注于天然抗肿瘤药物及其衍生物。本研究结果表明，紫草素在体外可抑制A549细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与线粒体凋亡途径以及PI3K/Akt信号通路相关。为临床上应用紫草素治疗肺癌提供了新的实验证据和理论基础。然而，肿瘤的发生与发展涉及多个方面，紫草素是否对肺癌细胞的PTEN、mTOR、P-JNK等产生作用，有待进一步研究。此外，本实验主要为体外实验研究，紫草素对肺癌的抑制作用在体内是否仍有效，有待进一步探讨。
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Mechanisms of shikonin-induced apoptosis in lung adenocarcinoma A549 cells
【Abstract】Objective To investigate the effects of shikonin(SK) on apoptosis in human lung adenocarcinoma A549 cells and its underlying mechanism. Methods After treatment with SK at various concentrations for different times， the viabilities of A549 cells were examined by CCK-8 assay. Cell morphological changes were measured by DAPI staining. Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The expressions of Bax， Bcl-2， p-Akt and p-ERK1/2 proteins were detected by Western blotting. Results The CCK-8 assay showed that SK inhibited the proliferation of A549 cells in a dose-and time-dependent manner. Florescence microscope with DAPI staining showed apoptotic changes in A549 cells after treatment with SK. Compared with control group， the expression of Bax protein was up-regulated while the expressions of Bcl-2， P-Akt and P-ERK proteins were down-regulated(P<0.05). Conclusion The results suggest that SK may inhibit the growth of lung cancer A549 cells and induce apoptosis， and mitochondrial apoptosis pathway， PI3K/Akt pathway and ERK 1/2 pathway might be involved in the process.
【Key words】shikonin; non-small cell lung cancer; cell apoptosis; PI3K/Akt signal g pathway; ERK 1/2 signal pathway
doi：10.16118/j.1008-0392.2015.06.008
收稿日期：2015-06-23
基金项目：上海市医学会资助项目(SY10-5)
【中图分类号】R 734.2
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2015)06-0040-06