·基础研究·
【摘要】目的 应用同步辐射(synchrotron radiation, SR)衍射增强(diffraction enhanced imaging, DEI)对兔慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis, CGN)模型病变进行模型研究。方法 采用盐酸阿霉素以17mg/kg的2次注射量，2个月后5只新西兰大白兔慢性肾小球肾炎模型形成。抽取血液做肾功能检查，尿液做尿常规检查，切片做病理检查。动物处死后肾组织固定在4%福尔马林溶液里，准备DEI实验。另取5只正常的兔子做对照组。本实验在北京同步辐射装置4W1A X线实验站(射束能量14keV)进行。取摇摆曲线的腰位，做360度旋转平扫，同时取背景图像。最后用衍射成像软件重建图像，用MATLAB分析CGN和对照组病变区间的灰度差异。结果 在没有静脉注射成像对比剂条件下，DEI方法能清楚地显示两组肾脏微结构，包括动静脉系统，集合管，髓袢及肾小球，其空间分辨率达10μm。CGN组(91～112)的平均肾皮质比对照组(121～141)丢失较多、灰度值、T检验P<0.05。相同皮质感兴趣区(数据点450×80)灰度值定量分析，CGN组总灰度值(55～160)小于对照组(75～175)。DEI图像和病理图像有较多相似性，CGN组的病变微结构得以显示，归功于DEI相位成像(phase-contrast imaging, PCI)的原理优势，从而使应用SR DEI对CGN进行诊断的可能得以成为现实。结论 同步辐射衍射成像实验是一种新的影像学方法，结果表明，影像学形态的变化较CT、MRI、超声更细致明确，它使无创伤、无对比剂的慢性肾小球肾炎的动物模型诊断成为可能。未来随着实验设备的提高和图像分析操作的简易化，DEI很可能在临床上成为CGN诊断的一种新方法。
【关键词】同步辐射； 相位成像； 衍射成像； 慢性肾小球肾炎
慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis， CGN)是全球普遍性的肾脏疾病，也被称为隐形杀手。它的病理类型有很多，如弥漫性系膜增生型，节段性系膜增生型(包括IgA和非IgA型)，膜性增生型，膜性肾小球肾炎型，微小病变型，局灶性肾小球萎缩型，肾小球纤维化型，肾间质炎型，毛细血管袢萎缩性，肾小管萎缩型和肾皮质变薄型等。所有类型的CGN都有一个漫长的病程，最终不同类型的病理改变也都可以转换为肾小球萎缩，肾小管萎缩和肾间质的纤维化[1]。目前，临床上依然采用肾脏穿刺的病理检查为CGN的诊断金标准，病理穿刺荧光检查有很多优势，但该检查有创伤性，多重复限制性，无动态观察性，而且还有很多并发症，如血肿形成，节段性纤维化弥漫等。超声波检查法、计算机断层扫描CT及磁共振成像MRI作为无创伤性的传统影像学技术，都是以吸收成像为基础原理，而非相位成像原理。
同步辐射相位成像(phase contrast imaging， PCI)在医学领域的应用越来越广泛，尤其是在以轻元素为主的生物软组织中[2]，如肺组织、肾脏组织和心脏组织。PCI的优势原理就是，当X线穿过组织的时候，光的波幅和相位发生改变。波幅的改变在各种组织中都很小，而在轻元素软组织中相位的改变却很大，甚至于波幅改变的一千倍左右，所以很大程度上提高了软组织成像的分辨率，尤其是在组织表面折射率骤变的地方。在所有PCI方法中，DEI是最简单的方法之一。DEI是通过样本对X线的吸收，折射梯度及小角度散射的性质来获得图像的对比度的一种影像放射技术[3]。DEI涉及一个晶体分析仪，它是对样本折射回来的X线担当角度过滤器的作用。DEI最显著的优点是样品和检测器之间的分析晶体和单色晶体的协调一致性，可以在微弧度水平探测到穿过样品的X线强度的散射及反射。图像的分辨率也和电荷耦合器CCD的分辨率及探测器的分辨率相关。DEI比传统成像提供了更多信息对比[4]。折射图像在区分正常与非正常组织中具有较高的可靠性。越来越多同步辐射对肾脏疾病开始了新的研究，包括肾结石、肾缺血、肾癌。
在本次研究中，利用DEI技术对肾脏CGN模型的微结构进行研究，并采用正常肾脏进行了对照。在未注射成像对比剂的前提下，DEI方法可以提供清晰的肾脏微结构，包括动静脉，集合管，髓袢及肾小球。再应用3D重组图像软件和图像灰度值的检测软件对CGN病变图像进行分析。
1.1 动物模型的准备
在动物保护与使用委员会机构的方针指导下，10只2个月大小的健康雄性新西兰大白兔被购置作为本次实验的对象，平均体质量2～2.2kg。随机被分为两组，每组5只。为了制作CGN模型，第一组耳缘静脉注射17mg/kg盐酸阿霉素，隔一周再注射一次，2个月内共进行两次注射。第二组未注射任何药物并和前一组在相同的环境下饲养了2个月。两组兔都被关在控温动物房的标准兔笼里饲养，自由取水和兔食。2个月后，兔人道性处死。再立即结扎近端肾动静脉和输尿管进行每组兔的肾脏摘除术，结扎血管以保证肾脏内，血管结构的饱满度。摘除肾脏分别取去小块皮髓组织用于病理组织切片观察，剩下部分均固定在4%福尔马林溶液中，并进行各组肾脏的编号及标记。因为DEI实验的视野有限，所以每个样品取含皮质和髓质的部位，大小约2mm×7mm×7mm，切面平整。
1.2 组织学检查和实验室肾功能检查
组织学检查和实验室检查均在同济大学附属第十人民医院进行。实验室检查显示各组兔血尿素氮(BUN)和肌酸酐(Cr)值，见图3，及尿蛋白值见表1。结果表示肾炎模型组和对照组兔均未见明显肾功能异常，但尿蛋白差异表示肾炎模型组已经出现肾单位结构的损伤病变。各肾脏组织经过固定、包埋H-E染色等步骤后分别在光镜下观察。结果病理图像皮髓质改变与DEI图像相一致。
1.3 DEI实验
储存环的能量是2.5GeV，电流量是250mA，而线站接收到用于DEI实验的光能是14KeV。为了能获得更高质量的图像，两块硅(1 1 1)晶体植入于实验装置中。从单色晶体摇摆器获得的X线穿过样品又被分析晶体折射，然后被高敏锐的CCD探测。CCD像素近10.9μm×10.9μm(X射线快速数码成像仪18mm相机系统，Photonic-Science英国有限公司)。分析晶体在装置中角度不同，样品及其表面的敏感性也不同。实验的成像视野即光斑大小约9mm×9mm。肾脏组织用强力胶被固定在一个塑料针头上，放置于两块晶体之间的样品旋转台上，并调整好样品的精确位置完整位于光斑内，即使360度旋转也位于光斑内。旋转台由步进电机驱动。首先扫描摇摆曲线，选择右侧下腰位B点作为光源切入点。实验表明B点相对A、C点，图像的分辨率最高，如图1所示，虽然有以往研究表明峰位A点是最佳扫描点。折射角分辨率表明DEI系统辨别样品折射后光线的能力，起到评估DEI系统属性的作用，这与传统的成像方法有很大的不同。两组样品都进行了360度相位衬度体层成像扫描，每0.5度采集一帧图像，曝光时间为120ms。扫描完成后，每个样品一共721张图像，包括一张无样品背景图。实验对位置偏移的现象进行了讨论，并验证其在计算机仿真实验基于当量直线传播模型。实验所有参数的选择都在反复验证中确定，以获取最高清晰度的图像。
图1 摇摆曲线的原理图
Fig.1 The schematic diagram of rocky wave
A，B，C点分别代表衍射实验中三个不同性质的位置(A峰位，B右下腰位，C左上腰位)，B点对实验的分辨率和光通量的稳定性具有最佳的贡献
1.4 图像处理
软件原理来源于一个并行计算法，可以提取样品折射率，沿着x轴和y轴的折射方向导数来完成三维CT重建，它结合了BSRF光源特征和断层重建，提供了一系列信息分离重建算法。图2(a)显示处理中的一个样品数据。每个样品已完成了360度成像，但是因为样品本身形状对称度和摆放样品的位置都没有精确的标准，所以在同一平面相反的两张成像图完成了点对点的角度及转轴的平衡校正。然后采用Avizo Fire软件通过图像分割和容积渲染技术将直观测量的可视化二维图转化为直观量化和骨架化三维图、可视化三维图像。
(a) DEI图像三维重建计算公式：
(b) 图显软件正在重建图像的过程
图2 图像重建过程
Fig.2 Reconstruction Processing Graph
1.5 统计分析
统计分析对本次研究至关重要，DEI图像、实验室和病理数据都需要统计参与分析。在本次研究中IBM SPSS 19和Matlab (R2013a)两大软件被采用。
血尿素氮(BUN)和肌酸酐(Cr)与肾功能相关，而尿蛋白与肾单位，尤其是基底膜(GBM)损伤与否相关。通过SPSS统计两个独立样本方差齐性，采用配对t检验，表明两组兔血BUN并没有明显差异，显著值P>0.05；Cr也没有明显差异，显著值P>0.05。而尿蛋白的显著值(P<0.05)表明两组兔子的肾单位损伤是有明显差异的，签于CGN模型组的尿蛋白普遍都是阳性可以推断该组肾脏微结构有损伤。进一步采取MA，TLAB软件灰阶提取编程，取20张DEI图像(共20个样品，一只兔子两个肾脏，每个样品随机取一张图像)。其中最大样品图像有4×106个数据点(一个矩阵内含2000×2000数据点)。皮质部分对肾小球肾炎病变是最重要的。选取皮质部分作为感兴趣区(ROI)。两组图像皮质区平均灰阶值所示，表明CGN模型组灰阶值普遍低于对照组，SPSS软件两组皮质灰阶值t检验显著值P<0.05，表明有明显差异。从CGN组挑出一张肾脏成像图，并且该肾脏的兔子蛋白尿阳性及病理结果显示肾脏微结构损伤；另在对照组随机取一张成像图。分别对皮质感兴趣皮质区内任意36000(450×80)个数据点进行统计分析，表明CGN组皮质区总灰阶值较对照组低。
2.1 肾功能检查
血尿素氮(BUN)和肌酸酐(Cr)检查结果如图3(a)和(b)。表明两组肾脏肾功能没有明显差异，且都属于正常。尿蛋白定量试验(磺基水杨酸溶液)如表1所示，正常参考值为阴性，阳性表明CGN组具有一定的肾单位损伤。
图3 BUN和CR 值在两组兔子间的对比
Fig.3 Comparison BUN and CR between two groups
表1 尿蛋白定量试验(磺基水杨酸溶液)
Tab.1 Comparison of urinary protein between two groups
肾炎组蛋白对照组蛋白+—++—++±+++—++±
正常尿蛋白参考值为阴性，阳性表明CGN组具有肾单位损伤
2.2 病理结果
分别定性对比观察两组肾脏间组织学、DEI及三维图片，如图4。(a)图正常组代表(d)图CGN组代表，都是放大100倍的H-E染色组织切片图。正常组显示完整健全的肾小球、肾小囊、肾小管结构，清晰的系膜和间质。CGN组显示肾小囊损伤，肾小管稍扩张，间质水肿，细胞浸润。CGN因为足突细胞的损伤及电荷屏障的丢失，白蛋白分子选择性溢出从而形成了蛋白尿。病理下肾小球毛细血管袢有增多的内皮细胞，上皮细胞，系膜细胞及白细胞，很容易与正常肾脏区分。两组病理图像改变与其对应的DEI图像(b)和(e)相一致。
2.3 DEI图像结果
对照组DEI图像和CGN组DEI图像代表分别是图4(b)和(e)，是图5(a)和(c)的放大图像。两组代表DEI图像都可以观察到肾脏微结构，其中图4(b)肾单位、肾小管及肾间质较清晰，(e)间质模糊渗出性改变，系膜增生。但是肾小球形态的比较却比较困难。DEI三维图代表如图4(c)和(f)所示。(c)对照组肾脏微结构清晰，血管形态正常，(f)CGN组结构稍紊乱，微血管增生、扭曲。冠状位对照组和CGN组代表如图5(a)和(c)所示，包括皮质区(CO)、外髓外带区(OSOM)、外髓内带区(ISOM)及内髓区(IM)。在不同灰阶下易区分各带，同时可观察到动静脉，包括间叶血管和弓形血管，集合管，分辨率约10μm。
2.4 统计结果
皮质区病变统计对诊断CGN有重大意义。以上是DEI图像的病变形态结果，应用MATLAB和SPSS对两组肾脏代表的相同矩阵大小的皮质区域进行灰阶值的提取和比较，如图5(b)和(d)所示。将两组肾脏平均灰阶值做比较，如(f)所示，发现CGN组平均灰阶值(91～112)普遍低于对照组(91～112)，t检验P<0.05。然后取两组各一代表，对相同矩阵大小(450×80)的皮质区域进行灰阶值分析，共36000数据点灰阶值结果如(e)所示，发现黑色曲线较绿色曲线左移，CGN组皮质区灰阶值(55～160)总数小于对照组(75～175)，黑曲线呈跳跃性分布也预示着它的灰阶值呈小局域性分布。
图4 定性对比观察两组肾脏间组织学(H-E染色×100)，DEI及三维图
Fig.4 The qualitative observation of cortex from control kidney and the CGN kidney in all three different modalities
(a)图正常组代表，显示完整健全的肾小球、肾小囊、肾小管结构，清晰的系膜和间质；(d)图CGN组代表，显示肾小囊损伤，肾小管稍扩张，间质水肿，细胞浸润；(b)和(e)放大的对照组DEI图像代表和CGN组DEI图像代表。两图可以观察到肾脏微结构，(b)肾单位、肾小管及肾间质较清晰；(e)间质模糊渗出性改变，系膜增生；(c)对照组肾脏微结构清晰，血管形态正常；(f)CGN组结构稍紊乱，微血管增生、扭曲，间质系膜增多
图5 冠状位对照组和CGN组代表
Fig.5 Coronal sections of kidney DEI images
(a)和(c) 皮质区(CO)、外髓外带区(OSOM)、外髓内带区(ISOM)及内髓区(IM)清晰所示，可观察到动静脉，包括间叶血管和弓形血管，集合管，分辨率约10μm。(b)和(d)两组相等大小皮质感兴趣区域。分别提取它们灰阶值用于统计分析。(e)两组图像相同感兴趣区域的灰阶值统计结果。CGN灰阶值组明显低于对照组。(f)两组肾脏的平均灰阶值比较，CGN组低于对照组
DEI基于相位衬度的原理，是相位衬度成像技术的方法之一。相位衬度成像能探测到邻近媒介的微小折射率变化，来渲染媒介边缘，从而被认为是肾脏成像的最可靠的方法[5]。在这种方法下成像对比剂是不需要的。最终决定成像质量的因素包括探测器的空间分辨率，具体的成像机制，光源的能量和光束发散率。至今已有很多关于肾脏的同步辐射研究，但是大多研究都采用微型CT设备。虽然微型CT比传统成像方法有更高的分辨率，但是它依然是基于吸收成像的原理，因此对比剂在此类研究中是很有必要的。而对比剂往往都是具有毒性的，虽然目前对比剂安全性较可靠，但它始终具有副作用，特别是对本身患有肾病的患者，损伤的肾小球不能正常代谢对比剂，潴留时间过长还可能导致对比剂造成的肾病(CMN)及急性肾功能衰竭，慢性病变有肾单位萎缩、坏死，系膜增生，肾缺血及抗药性炎症反应。
同步辐射DEI是一种无创伤，无需对比剂就能提供高分辨率来观察肾脏微结构的成像方法，通过肾脏微结构形态学和灰阶值分析，它给了未来诊断慢性肾小球肾炎疾病一条新的思路[6]。将来DEI再结合CGN相应的实验室检查，CGN便可诊断，合理的治疗可迅速实施[7]。随着同步辐射技术的迅速发展，会更加安全有效的医学成像设备[8]。
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Synchrotron radiation diffraction enhanced imaging in research of rabbit chronic glomerulonephritis model
【Abstract】Objective To investigate microstructural changes in chronic glomerulonephritis(CGN) under diffraction enhanced imaging(DEI) technology of synchrotron radiation(SR) in rabbit model. Methods Chronic glomerulonephritis(CGN) was induced by injection of doxorubicin hydrochloride in 5 New Zealand white rabbits. The blood and urine tests and kidney histological examination were performed 2 months after CGN induction. The kidney tissues were fixed into 4% formalin solution for one week before DEI experiment. The experiment was performed at Beijing Synchrotron Radiation Facility(BSRF) 4W1A beam line(beam energy was 14keV). On routine scanning process， the rocking curve was detected， and slope position on the curve was selected for a 360° spatial CT scan， at last the DEI reconstruction software was applied for 3-dimensional image， meanwhile the DEI image grey value between chronic CGN group and control group was analyzed by MATLAB and SPSS. Results Without radio-contrast， DEI provided clear visibility of the microstructural views of artery， vein， straight collecting ducts， papillary tubules， glomeruli of kidneys in both groups， with the spatial resolution of 10μm. The cortex of CGN lost more gray value comparing to the normal one. There was good correlation between DEI images and histopathological images. The microstructural change of CGN kidney was revealed， which was based on the advantage of phase-contrast imaging(PCI) mechanism， and the diagnosis value of CGN by synchrotron radiation(SR) phase-contrast imaging(PCI) technology was evaluated.Conclusion Synchrotron radiation diffraction enhanced imaging(DEI) provides non-invasive and non-contrast diagnosis of CGN in animal model， which may used in clinical diagnosis after further improvement.
【Key words】synchrotron radiation; phase contrast imaging; diffraction enhanced imaging; chronic glomerulonephritis
doi：10.16118/j.1008-0392.2015.06.005
收稿日期：2015-05-14
基金项目：国家自然科学基金(11ZR1427800，11205189，81271574)
【中图分类号】R 586
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2015)06-0024-07