TGFβR2作为非小细胞肺癌伴随诊断分子的探讨

(1. 同济大学附属第十人民医院核医学科，上海 200072; 2.吉林大学附属中日联谊医院皮肤科，长春 130031)

【摘要】目的定量分析转化生长因子受体2(Transforming growth factor receptor 2， TGFβR2)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)及其癌旁组织中的表达，探讨TGFβR2的表达在NSCLC伴随诊断(companion diagnostic，CD)中的意义。方法取患者手术中立即取材置于液氮中的新鲜组织标本(90例NSCLC组织，40例癌旁肺组织)，抽提RNA，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测标本。TGFβR2基因表达量通过2-ΔΔCT方法计算。TGFβR2的表达用

呈现。独立样本t检验比较两组差异，应用Kaplan-Meier生存分析来评估总生存期(Overall survival， OS)和无进展生存期(Progression-free survival， PFS)。结果实验结果表明NSCLC组织中TGFβR2的表达(3.19±4.28)显著高于癌旁肺组织(1.01±0.41)，二者差异具有统计学意义。生存分析显示TGFβR2高表达的NSCLC患者预后不良，总生存期和无进展生存期明显降低。结论 TGFβR2可以作为NSCLC潜在的伴随诊断分子标志物。

【关键词】转化生长因子受体2；非小细胞肺肿瘤；伴随诊断；荧光定量PCR

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)是原发肺癌最常见的类型，占肺癌的85%左右[1]。随着分子生物学和表观遗传学的不断进展，证实EGFR、KRAS、ALK、MEK、PI3K、BRAF等驱动突变导致NSCLC发生发展[2-4]。检测驱动基因，针对性抑制药物进行干预治疗，从而改善治疗效果及预后；提供驱动基因信息并指导临床靶向治疗的诊断称为伴随诊断[5]。评估潜在的伴随诊断分子，有助于针对性靶向治疗。TGFβ信号通路与NSCLC的进行进展有密切的关系。目前，使用反义寡核苷酸AP 12009靶向抑制TGFβR2作为有前景的治疗手段治疗恶性胶质瘤和TGFβR2过表达的其他高侵袭性肿瘤[6]。本研究采用RT-qPCR探索TGFβR2在NSCLC中表达水平，Kaplan-Meier单因素生存分析研究TGFβR2表达对NSCLC总生存期和无病进展期的影响。

1 材料与方法

2011至2013年接受外科切除手术的NSCLC患者的新鲜组织样本，组织样本来自于吉林大学组织样本库。样本包括90例癌组织及40例癌旁组织，均通过病理明确诊断，TGFβR2在NSCLC的表达量与临床特征之间的关系见表1。所有NSCLC癌患者均根据第七版美国癌症联合会(NJCC)TNM分期系统进行了分期[7]，且所有患者的信息皆于2014年9月30日前收集完整。本研究遵循协议并且经吉林大学组织样本库伦理委员会批准。本研究遵循协议并且经同济大学附属第十人民医院伦理委员会批准。

DEPC水(Sigma公司)，TRIzol(Invitrogen公司)，Prime Script TM RT-PCR试剂盒(Takara公司)，无水乙醇、氯仿、异丙醇(上海联试化工试剂有限公司)，SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara公司)，实时荧光定量PCR引物(上海华大基因公司)，Real-time PCR扩增仪(Invitrogen公司)，无RNAase枪头及EP管(Axygen公司)，微量移液器、电动移液器(美国Eppendorf公司)。按照使用说明书推荐的条件和步骤进行操作。

1.3 实时荧光定量PCR法检测TGFβR2表达水平

将研磨好的NSCLC和癌旁肺组织标本置于无酶EP管内，加入适量Trizol提取总RNA，按TaKaRa公司PrimeScript TM RT-PCR试剂盒说明书进行反转录合成cDNA，将cDNA保存于-20℃。使用Real-time PCR扩增仪，按TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq Kit进行实验，反应条件： Stage1 预变性95℃ 2min1 Cycle；Stage2 PCR反应95℃ 30s、Taopt. 15s 72℃ 10s 收集荧光；Stage3熔解曲线分析95℃ 15s、65℃ 15s、95℃ 15s荧光采集模式40Cycle。引物序列(表2)。应用2-ΔΔCt法对目的基因表达的相对定量。

所有的统计分析采用IBM SPSS statistics for Windows，版本为19.0(IBM Corp.; Armonk， NY， USA)的统计软件包进行数据处理。TGFβR2的表达用

偏差呈现。独立样本用t检验进行组间差异分析。Kaplan-Meier曲线来确定各组的总生存率，结果与对数秩检验比较。P<0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 TGFβR2在NSCLC癌组织和癌旁肺组织的表达分析

利用RT-qPCR在NSCLC患者癌组织(n=90)及癌旁组织(n=40)检测了TGFβR2的mRNA表达水平。实验结果显示，TGFβR2的表达在NSCLC肿瘤组织(3.19±4.28)较癌旁组织(1.01±0.41)显著增加，差异有统计学意义P=0.002(表3)。

2.2 TGFβR2的高表达是NSCLC患者伴随诊断分子标志物

利用Kaplan-Meier对不同TGFβR2表达水平的NSCLC进行生存分析。结果显示，高表达的TGFβR2的患者其预后较低表达患者生存时间明显缩短。NSCLC患者中，TGFβR2高表达与OS及PFS有显著负相关。TGFβR2的高表达明显使OS减少(P<0.001，图2A)PFS降低(P=0.001，图2B)。根据生存分析模型，在NSCLC患者中，高表达的TGFβR2可认为是生存期缩短的一个预测标志物。在个体化靶向治疗中，可以作为一个潜在的伴随诊断分子标志物。

3 讨论

伴随诊断是发现驱动基因最重要的手段，对于靶向治疗，效果事半功倍；伴随诊断的主要方法是RT-qPCR(实时荧光定量PCR)技术，IHC(免疫组织化学)技术和FISH(荧光原位杂交)技术。FISH和RT-qPCR结果判断客观。CFDA已经批准RT-qPCR应用在临床检测。本研究采用快速、简便易行的RT-qPCR定量分析检测方法。个体化治疗靶向药物的临床应用需要伴随诊断分子标志物提供基因信息，从而进行临床决策[5]。

NSCLC临床分子病理学的相关机制尚不明确。体外实验证明反义寡核苷酸AP 12009抑制TGFβR2过表达的肿瘤细胞转移，被用于治疗高侵袭行为肿瘤，比如胰腺癌、恶性黑色素瘤、恶性胶质瘤[6，8]。然而，没有伴随诊断标志物针对性地预测哪些分子类型恶性肿瘤可以进行靶向抑制治疗。2013年美国三所学会联合发布EGFR、ALK酪氨酸激酶抑制剂治疗指南[9]，NSCLC靶向治疗将会根据分子靶点的确定进行临床决策和管理。所以，发现新的伴随诊断分子标志物可以进一步明确分子靶点，通过靶点检测技术早期诊断并开发靶向药物治疗NSCLC，使TGFβR2阳性患者从相应的靶向药物抑制剂治疗中获益，提高临床应用和疗效。

在研究中发现TGFβR2在肺癌组织中的表达量明显高于相对应的正常肺的癌旁组织，研究结果与之前Chen[10]的研究结果并不一致。尽管特定的分子机制还不明确，但是明确的是TGFβR2使TGFβR1磷酸化，被激活的TGFβR1使下游的靶基因Smad2和Smad3磷酸化，磷酸化的Smad2和Smad3与Smad4形成复合物，转移到细胞核并调节靶基因持续表达[11-12]。TGFβR2的过表达可能会导致肿瘤的发生发展。与之前研究结果不一致的原因可能是：我们选择的是癌和相对应的癌旁组织，而且本研究的样本量也较大，选择90例癌组织和40例相对应的癌旁组织，Chen样本量只有60例。

本研究发现，在NSCLC患者组织中(n=90，3.19±4.28)TGFβR2 mRNA的表达显著高于癌旁肺组织(n=40，1.01±0.41)。二者差异具有统计学意义。生存分析显示，TGFβR2高表达的NSCLC患者预后不良，OS和PFS明显降低。过表达的TGFβR2患者总生存时间明显缩短，TGFβR2可以作为NSCLC潜在的伴随诊断分子标志物。

进一步研究了与TGFβR2表达相关的临床病理特征，TGFβR2的表达与肿瘤的分化程度具有相关性，在低分化NSCLC组织中TGFβR2的表达量明显高于中等分化和分化较好的NSCLC组织(P<0.05，表1)，分化程度越差，TGFβR2表达量越高，这预示TGFβR2在NSCLC进展中起重要作用。此外，TGFβR2在淋巴结转移和肺膜侵袭的患者中显著高表达(P<0.05，表1)，这一结果预示TGFβR2过表达可能与肺癌的转移和侵袭有密切的关联。

伴随诊断分子反应特定药物的靶点，在于一些治疗无关的非特异性的药物，为未来的靶向治疗提高与新的潜在的标志物造福临床[3，13]，通过分子生物学和表观遗传分析，在基因组学和蛋白组学等技术的支持下，对大样本人群和特定的肿瘤疾病进行肿瘤分子标志物，检测分析[14]，通过IHC、FISH和RT-qPCR等技术验证鉴定，找到肿瘤的原因和治疗靶点，把相关分子病理亚型精确分类，最终实现靶向诊断和个体化治疗，提高生存时间和治愈效果[15-16]。

本实验通过肿瘤样本验证差异表达和生存分析，研究了TGFβR2的表达对NSCLC生存预后的影响，但仍有许多问题没有揭开，相关的分子机制还不清楚，本课题只是在mRNA水平上验证表达，还缺少蛋白水平的验证，下一步将在扩大样本量的同时，进一步通过免疫组织化学、Elisa等方法在蛋白水平验证，结合临床信息继续阐释。接下来的研究中将构建TGFβR2的过表达细胞系，再结合基因，敲除小鼠进行动物实验，在此基础上研究肿瘤发生、进展、转移的相关机制，并对癌组织中TGFβR2测序，希望最终可以找到治疗晚期肺癌的一个新的靶标。

以上结果表明，TGFβR2可能成为一种新的分子标志物应用于临床实验和临床诊断，改善靶向治疗临床决策和治疗效果，具有潜在的临床应用价值，尝试发现一个新的，基于信号通路和基因，具有对个体化治疗指导意义的，作为评估NSCLC生存预后的驱动基因，通过评价NSCLC中TGFβR2的表达与临床特征之间的关系，尝试能够发现用于预测生存预后的新的肿瘤生物标志物。

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HAN Yang1， MA Yu-shui1， FU Da1， CONG Xian-ling2， YU Fei1， LV Zhong-wei1

(1. Dept. of Nuclear Medicine， Tenth People’s Hospital， Tongji University， Shanghai 200072， China; 2. Dept. of Dermatology， China Japan Union Hospital， Jilin University， Changchun 130031， China)

【Abstract】Objective To determine the expression levels of transforming growth factor receptor 2(TGFβR2) in non-small cell lung cancer(NSCLC) and its significance. Methods Total RNA was extracted from NSCLC tissue(n=90) and adjacent non-cancerous tissue(n=40)， Real-Time quantitative PCR was performed. The 2-ΔΔCT method was used to quantify the expression levels of TGFβR2. Independent t-test was performed to examine differences between two groups， Kaplan-Meier curves were used to determine overall survival(OS) and progression-free survival(PFS) of patients. Results TGFβR2 expression in NSCLC tissue was significantly higher than that in adjacent non-cancerous tissue(3.19±4.28 vs 1.01±0.41，P<0.05). Kaplan-Meier survival analysis demonstrated that prognosis was worse in patients with high expression of TGFβR2. Expression of TGFβR2 was significantly associated with decreased OS and PFS in NSCLC patients. Conclusion TGFβR2 might be used as a bio-marker for companion diagnostics of non-small cell lung cancer.

TGFβR2作为非小细胞肺癌伴随诊断分子的探讨

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

2 结果

3 讨论