·基础研究·
氧化应激诱导的大鼠Müller细胞微小RNA表达谱的初步研究
张介平1,2,3， 郑 莉1,2,3， 王 娟1,2,3， 吕立夏1,2,3， 徐国彤1,2,3
(1. 同济大学医学院眼科研究所，上海 200092; 2. 同济大学医学院再生医学系，上海 200092; 3. 同济大学医学院干细胞研究中心，上海 200092)
【摘要】目的 研究在氧化应激条件下视网膜Müller细胞的miRNA表达谱，为寻找氧化应激条件下Müller细胞的靶向分子提供线索。方法 用2mmol乙二醛处理大鼠Müller细胞48h，然后收集细胞，抽提总RNA，本研究采用小RNA两端加接头序列，反转录，克隆，随机测序的方法构建大鼠Müller细胞系的小RNA文库，序列经Genebank Blastn和miRBase比对分析，Mfold软件在线预测二级结构验证miRNA，经qRT-PCR鉴定miRNA，通过miRPath分析müller细胞表达的miRNA相关信号通路。结果 本文库获得163个有效序列，31个克隆为已知miRNA序列，代表13种miRNA，它们与PI3K-AKT，MAPK，细胞外基质的合成及相互作用等多条信号通路密切相关。发现1个新miRNA序列。结论 氧化应激条件下表达的miRNA为更好地了解在生理和疾病条件下的Müller细胞功能提供有益的线索。
【关键词】氧化应激; 微小RNA; Müller细胞; 大鼠
miRNA是一种长度约为18～25个碱基的内源性非编码RNA[1]，编码miRNA的基因约占人类基因组的1%～3%[2]。它参与了动植物的转录后调控，通过与mRNA碱基互补配对，抑制mRNA的翻译或使mRNA降解。在人类和其他哺乳动物中，约60%基因受miRNA调控[3]。这种调控作用遍及广泛的生物活动以及疾病发生过程。
Müller细胞在视网膜中处于重要地位，90%以上的视网膜胶质细胞为müller细胞，其突起跨越内界膜到外界膜整个视网膜厚度，与视网膜各层细胞存在多方面相互作用。在几乎所有的视网膜病理过程中，如外伤、青光眼、糖网病和年龄相关的黄斑变性等，Müller细胞均会发生再度活化[4]，通过释放神经营养因子、自由基清除剂，摄取谷氨酸和易化新生血管生成来保护神经元；另一方面，Müller细胞可以去分化，被诱导为其他视网膜终末神经细胞，参与视网膜再生[5-6]。Müller细胞既发挥神经元保护作用，同时也参与视网膜损伤和疾病的病理。深入研究Müller细胞的功能有助于寻找治疗视网膜疾病的新的切入点。
近年来，许多研究相继报道miRNA在眼部组织视角膜、晶状体、视网膜的差异表达模式。Ryan发现17种miRNA在哺乳动物晶状体和(或)睫状体表达[7]。Banfi等[8]利用基因芯片方法发现至少70种miRNA在成年小鼠神经视网膜区域性表达，20种miRNA在晶状体表达，54种miRNA在角膜表达。这些区域性表达的miRNA可能在维持正常眼组织的功能方面发挥重要作用。目前关于Müller细胞的miRNA表达数据有限。本研究构建氧化应激条件下大鼠Müller细胞小RNA文库，通过生物信息学方法和qRT-PCR技术对其表达的miRNA进行鉴定和验证，为更好地理解Müller细胞的功能，寻找Müller细胞的靶向分子提供有益线索。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
大鼠Müller细胞系(rMC-1)由Vijay Sarthy(Northwestern University， Evanston， IL)馈赠。培养基为DMEM/high glucose(Hyclone， SH30022.01B)，10%FBS(GEMINI，900108)，1%P/S(Beyotime， C0222)。2mmol乙二醛(Sigma，128465)，处理细胞24h后收样。
1.2 小RNA的提取
RNAiso Plus(Takara，D9108B)提取Müller细胞总RNA。取400μg总RNA进行15%变性PAGE凝胶电泳，切取16～28nt之间的凝胶块，根据Small RNA回收试剂盒(Takara， D9106)说明书操作方法回收小RNA片段，用超微量核酸蛋白测定仪NDl000(NanoDrop Technologies， USA)检测核酸浓度和小RNA质量后用于小RNA文库构建。
1.3 小RNA文库构建
根据Xue等[9]的方法建立小RNA文库，具体步骤如下： (1) 小RNA用虾碱性磷酸酶(Takara， D2660A)脱磷酸，然后用T4 RNA连接酶(Takara，D2050A)与3′端接头(5′-pacuGTAGGCACCA-TCAAx-3′)(lower-case nucleotides， ribonucleotides; p， phosphate group; x， C6-NH2 modification)连接，3′端的进一步连接被3′端接头序列中的C6-NH2基团所阻滞。(2) 3′连接产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及纯化。(3) 纯化产物5′端重新磷酸化，然后与5′接头(5′-TCGTaggcacctgaaa-3′)连接。(4) 连接产物用15% PAGE电泳分离及纯化。(5) 反转录： 根据反转录试剂说明书(takara， D2639A)，以纯化的连接产物为模板，以5′-ATTGATG-GTGCCTAC-3′(与3′端接头寡核苷酸序列互补)为特异反转录引物进行逆转录。(6) PCR扩增： 根据5′端接头的序列和特异逆转录引物序列，使用相应的上游引物5′-ATTGATGGTGCCTACAG-3′，下游引物5′-ATCGTAGGCACCTGAAA-3′(其中含有BanI限制性酶切位点)，利用2×Taq mix(Transgene，AS111)进行PCR扩增。(7) 连接转化： 扩增产物纯化，BanI酶切，与pGEM-T Easy vector (Promega， A1360)连接，后转化trans5α感受态细胞(transgene，CD201)。(8) 涂板培养，随机挑单克隆测序。
1.4 miRNA鉴定
测序得到的RNA序列经NCBI(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blastn程序搜索GenBank中的非冗余数据库(non-redundant database， NR)，无同源序列的再与miRBase verision10.0数据库进行比对，序列相同或高度相似则鉴定为müller细胞表达的miRNA，剩余的序列可能为Müller细胞表达的新miRNA，经UCSC(http：∥genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)确定其基因组定位及上下游各100nt的序列，经Mfold(http：∥mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form2.3)折叠，预测是否有茎环结构形成。当该可能miRNA序列位于二级茎环结构的臂上，自由能低于-30，则列为大鼠Müller细胞候选的miRNA，可进行下一步验证。
1.5 miRNA验证
根据候选的大鼠Müller细胞miRNA序列，参考Varkonyi和Chen等[10]的方法设计相应反转录茎环引物和qRT-PCR引物，根据反转录试剂说明书(Takara， D2639A)，以Müller细胞小RNA为模板，用相应的茎环引物进行反转录。再以反转录产物为模板，按SuperReal PreMix(Tiangen， FP205)说明书进行qRT-PCR，扩增相应小RNA序列，同时以U6为内参基因。qRT-PCR仪为ABI 7500(Applied Biosy-stems， USA)，每个反应重复2次。qRT-PCR程序为： 95℃，15min；40个循环： 95℃，15s；60℃，1min。扩增结束后进行熔解曲线分析，比较目的基因和U6的CT值，目的基因与阴性对照的Tm值评估反转录及扩增的有效性和产物的单一性。
1.6 miRNA相关通路预测分析
将文库中已知的13种类miRNA，用DIANA miRPath v.2.0[11]分析其组合作用显著的信号通路，寻找可能影响的主要信号通路和重点调控的蛋白，为大鼠Müller细胞相关的miRNA研究提供新思路。该软件数据库未收录大鼠数据，而本文库中获得的13个miRNA序列与小鼠相应miRNA序列比对，完全一致，使用miRPath的小鼠数据库预测文库中miRNA的功能。
2 结 果
2.1 文库中的小RNA分子长度分析
本cDNA文库用16～28nt的小RNA构建，共检测183个含有插入序列的克隆被随机挑选，测序分析，除去形成引物二聚体或测序错误克隆外，共得到163个待分析的小分子RNA。尽管文库中的小RNA分子长度最短为15nt，最长为36nt，但它们的分布主要集中在20～26nt，这一分布特点符合Dicer酶加工作用的特点[12]。
2.2 文库中的小RNA分子类别分析
所测得的小分子RNA序列首先用NCBI的Blastn程序搜索GenBank中的非冗余数据库，确定其类别，这些序列中有各种细胞RNA，其中大部分为核糖体RNA降解序列，少数为tRNA，snRNA和mtRNA及mRNA降解片断，其余无同源的序列，与mirbase中的成熟miRNA序列比对，测序的RNA序列中有31个克隆和已知miRNA高度同源，见表1。进一步分析，这些miRNA代表13个不同的miRNA序列。
表1 氧化应激诱导的大鼠Müller细胞的miRNA表达
Tab.1 Expression of miRNAs in rat Müller cells under oxidative stress
序号序列名称拷贝数长度1TAGCAGCACATAATGGTTTGTGrno-miR-15a6222TCCCTGAGACCCTAACTTGTGArno-miR-125b4223TAGCTTATCAGACTGATGTTGArno-miR-214224TAGCAGCACGTAAATATTGGCGrno-miR-164225AGGCAAGATGCTGGCATAGCTGrno-miR-313236ATCACATTGCCAGGGATTTCCrno-mir-23a3217TTCACAGTGGCTAAGTTCCGCrno-miR-27a1218AGCTACATCTGGCTACTGGGTrno-mir-2221219AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTCrno-mir-22112310TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTrno-let-7a12211AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTrno-miR-2212212TAGCACCATTTGAAATCGGTTArno-mir-29c12213CAGCAGCAATTCATGTTTTGGArno-mir-322122
2.3 大鼠Müller细胞表达的新miRNA鉴定
文库中不能归为任何一类已知小RNA的11个序列，经UCSC确定其基因组定位及上下游各100nt的序列后，用Mfold软件在线进行二级结构预测，均可以折叠成茎环结构，被归类为待定miRNA，其中仅有3个miRNA(文库中的位置号码分别为： G272，G206，G82)位于二级茎环结构的某一侧臂上，且自由能较低，G272的自由能为-31.6，G206的自由能为-47.8，G82的自由能为-62.2(图1)，均可能为在大鼠Müller细胞表达新的miRNA。
2.4 miRNA的qRT-PCR验证
根据本研究克隆鉴定的13个已知miRNA和3个候选大鼠Müller细胞miRNA序列，分别设计特异的反转录茎环引物和上游引物，下游引物为公用，具体序列见表2。qRT-PCR结果表明： 13个已知miRNA的CT值均<30，溶解曲线单峰，Tm值在80℃左右(表3)，证实这13个miRNA在大鼠Müller细胞的表达。3个候选miRNA中，其中G272的CT值<35，且溶解曲线单峰，Tm值明显高于阴性对照(图2)，提示G272可能为新的miRNA，但由于其CT值与其他已知miRNA及U6相比仍旧偏高>30，所以不排除是断裂基因的可能。G206和G82无扩增(结果未列出)，两者可能只是核糖体RNA断裂的小片段。qRT-PCR结果验证了大鼠Müller细胞miRNA的鉴定结果，为后续的Müller细胞miRNA表达模式分析奠定基础。
名称序列G272反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgacacgccaG272正向引物ttattacgcggcgcgggaaatgG206反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgacgaacggG206正向引物ttattaaagtgggaggcccccggcG82反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgacgcgcgcG82正向引物ttattagggcgggtgcggggggrno-miR-15a反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgaccacaaarno-miR-15a正向引物ctgccgtagcagcacataatggrno-miR-125b反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgactcacaarno-miR-125b正向引物ccgttatccctgagaccctaacrno-miR-21反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgactcaacarno-miR-21正向引物ccgccgtagcttatcagactgatrno-miR-16反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgaccgccaarno-miR-16正向引物ccgccgtagcagcacgtaaatarno-miR-31反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgaccagctarno-miR-31正向引物ctaccgaggcaagatgctggcatrno-mir-23a反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgacggaaatrno-mir-23a正向引物ctaccgatcacattgccagggrno-miR-27a反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgacgcggaarno-miR-27a正向引物cctccgttcacagtggctaagrno-mir-222反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgacacccagrno-mir-222正向引物ctaccgagctacatctggctacrno-mir-221反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgacgaaaccrno-mir-221正向引物ccaccgagctacattgtctgctgrno-mir-let7a反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgacaactatrno-mir-let7a正向引物ccgccgtgaggtagtaggttgtarno-miR-22反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgacacagttrno-miR-22正向引物ctaccgaagctgccagttgaagrno-mir-29c反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgactaaccgrno-mir-29c正向引物ccgccgctagcaccatttgaaatcrno-mir-322反转录引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgga-tacgactccaaarno-mir-322正向引物ccgccgcagcagcaattcatgttCommon-mir-revgtgcagggtccgaggt
表3 qRT-PCR方法检测小RNA文库中miRNA的CT值和Tm值
Tab.3 CT and Tm value of each miRNAs detected by qRT-PCR
基因名称平均CT值目的基因Tm值阴性对照Tm值rno-miR-15a18.9176.3362.56rno-miR-125b18.5278.4561.91rno-miR-2119.4280.2462.15rno-miR-1617.6178.6262.56rno-miR-3119.5976.5162.59rno-mir-23a18.2879.3962.41rno-miR-27a21.2577.3962.30rno-mir-22221.6479.6362.34rno-mir-22120.8778.9964.01rno-mir-let7a16.2478.0962.74rno-miR-2217.1879.8461.86rno-mir-29c19.2380.3962.23rno-mir-32222.8077.2165.26G27231.0076.9361.91U618.9677.7974.92
2.5 miRNA相关功能预测分析
以DIANA miRPath的路径总和(pathway union)模式分析，以0.001为P阈值，发现13个miRNA相关的KEGG通路，共有48条，将靶基因总数≤10的通路排除，最终获得27条通路(表4)。
表4 与文库中已知miRNAs显著相关的KEGG通路
Tab.4 Significant pathway related to miRNAs of rat Müller cells small non-coding RNA library (P<0.001)
KEGG通路P-值基因ECM-receptorinteraction(mmu04512)<1e-1618Focaladhesion(mmu04510)<1e-1657Proteindigestionandabsorption(mmu04974)1.11E-1620Tcellreceptorsignalingpathway(mmu04660)2.07E-1220PI3K-Aktsignalingpathway(mmu04151)<1e-1683ErbBsignalingpathway(mmu04012)8.22E-1318Insulinsignalingpathway(mmu04910)2.43E-1132mTORsignalingpathway(mmu04150)1.32E-1019MAPKsignalingpathway(mmu04010)3.03E-1029Wntsignalingpathway(mmu04310)4.00E-1018Neurotrophinsignalingpathway(mmu04722)2.75E-0931Amoebiasis(mmu05146)2.55E-1518Prostatecancer(mmu05215)4.44E-1530Axonguidance(mmu04360)4.94E-1425Pathwaysincancer(mmu05200)1.71E-1229
(续表1)
KEGG通路P-值基因Endometrialcancer(mmu05213)2.72E-1117Glioma(mmu05214)5.57E-1122Melanoma(mmu05218)7.50E-1014Renalcellcarcinoma(mmu05211)1.28E-0911Pancreaticcancer(mmu05212)1.98E-0911HTLV-Iinfection(mmu05166)3.19E-0824HepatitisB(mmu05161)5.94E-0815Smallcelllungcancer(mmu05222)7.57E-0714Transcriptionalmisregulationincancer(mmu05202)7.49E-0638Chronicmyeloidleukemia(mmu05220)8.29E-0618Ubiquitinmediatedproteolysis(mmu04120)1.07E-0817Proteinprocessinginendoplasmicreticulum(mmu04141)1.03E-0618
P值最小的前2位的通路分别是ECM-receptor interaction(细胞外基质受体相互作用)和Focal adhesion(粘着斑形成)，二者均与细胞基质有关，在细胞周期调控、粘附、迁移、生成等多方面发挥重要作用，这些通路的相关功能与Müller细胞突起跨越整个视网膜厚度的结构特点是一致的，提示这些miRNA可能对于müller细胞这种结构分布特点的形成与维持至关重要。14条路径与多种癌症等疾病相关，主要靶基因为E2F3，RAF1，BCL2，AKT3等，提示文库中miRNA参与调控Müller细胞的生长、增殖和分化等过程。显著相关的信号通路还有PI3K/AKT，MAPK，mTOR，ErbB，TCR等，这充分显示miRNA具有重要生物学意义，其调控作用广泛。
以P为0.05为阈值，进行聚类分析可将13个miRNA分为三组(图3)。a组包括： miR-221/222，miR-125b和miR-31，以路径交集(pathway intersection)模式分析，获得四个miRNA都显著相关的信号转导通路为MAPK通路，该通路参与细胞的生长、分化、应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程。b组包括： miR-15a/16，miR-322和miR-27a，以交集模式分析发现共有24条KEGG通路与4者均显著相关，提示其作用的广泛性，位于第一位是PI3K/AKT通路。c组包括： miR-21，22，23a，29c和let-7a，采用交集模式分析发现，除了miR-22，该组其他4个miRNA只与PI3K/AKT通路显著相关。PI3K-Akt信号通路是调节细胞增殖、分化和凋亡的重要通路。以路径交集模式按不同组miRNA分析结果提示PI3K/AKT通路及相关miRNA对于Müller细胞至关重要。
3 结 论
本研究以传统方法构建大鼠Müller细胞的小分子RNA文库，获得在氧化应激条件下大鼠Müller细胞的miRNA表达谱，鉴定13种已知miRNA在其中表达，并通过qRT-PCR初步验证了1个新的miRNA。Northern Blot是miRNA检测的传统方法，但难以区别仅相差1～2个碱基、高度相似的序列，并且需要设计特异的探针，费用高且通量有限。基因芯片是高通量检测miRNA的一种方法，但其费用高，后期数据处理难度大。本研究采用的特异茎环引物反转录后，qPCR方法能够对miRNA成熟体进行专一性检测，能区别同一家族不同成员的miRNA序列，特异性强。
鉴于测序深度有限，本文库没能发现更多的miRNA，但是文库中的13个miRNA应属于大鼠Müller细胞表达丰度较高的miRNA，它们的功能值得关注。本研究以文库中的miRNA为一整体，通过miRPath分析，探究它们在Müller细胞中共同参与调节的信号通路、生命过程或疾病，这种分析方法的优势在于能同时分析多个miRNA的靶基因，并将其效应整合到某一已知KEGG通路中，有助于了解多个miRNA共表达时的组合效应[13]。
在与这13个miRNA显著相关的KEGG通路中，有3条路径(即表4中的前三通路)涉及的靶基因主要为胶原蛋白，层粘连蛋白，整合素蛋白等，考虑到Müller细胞的最基本特点是跨越整个视网膜厚度，与所有的视网膜神经元胞体和突起相接触或包绕[4]，因此Müller细胞在生长发育过程中势必涉及大量与细胞外基质及其他细胞的相互作用，推测miRNA可能通过介导上述三条通路，很大程度地参与了这个过程，也许可以通过这些miRNA来改造相应信号通路，从而改变细胞命运[14]，影响Müller细胞与细胞基质及其他神经元的联系，用于防治严重胶质化导致的视网膜神经元死亡[4]，联合参与这三条通路的miRNA为miR-27a，29c，let-7a，它们可以作为Müller细胞中的重点研究对象。
PI3K/AKT是miRPath总和分析中第三个P值最小的显著相关通路，同时也是交集分析中，b组和c组miRNA(不包括miR-22)共同参与的通路，文库中与之相关的miRNA值得深入研究。PI3K/AKT信号通路是细胞内重要信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡的关键作用。Müller细胞对于视网膜缺血、缺氧或低血糖有着惊人的抵抗力[15]，在大多数视网膜损伤中都能存活，并在早期发挥积极的保护作用，比如营养其他神经元，清除病原体等，这种顽强的存活能力可能与PI3K/AKT通路的活跃有关，本文库中8个miRNA均有10个以上预测靶基因参与该通路，提示PI3K/AKT信号通路在Müller细胞中可能受到miRNA严密调控，也显示了其功能对于Müller细胞的重要性。
MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，转导细胞外刺激信号，引发细胞广泛的生物学效应(如细胞增殖、分化及凋亡等)。有研究表明，MAPK通路对视网膜发育过程中Müller细胞的形成非常重要，特异性的抑制MAPK磷酸化会显著减少müller细胞的数量[16]，Zhong等发现活化的胶质细胞通过激活MAPK通路诱导神经元死亡[17]，可见MAPK通路的抑制或激活均能引发胶质细胞严重的有害反应，维持MAPK信号通路的稳定对于胶质细胞很关键，本文库中a组4个miRNA均在MAPK通路富集，这些miRNA可能通过某种调节模式维持Müller细胞中MAPK通路的相对稳定性。
综上所述，本研究构建了源于Müller细胞的小RNA文库中，从而获得其miRNA表达谱，并发现一条在Müller细胞表达的新miRNA，通过miRPath分析，探究Müller细胞中高丰度表达的miRNA所介导的主要信号通路，有助于深入了解müller细胞的功能、特点及其机制，为以干预miRNA为手段的靶向Müller细胞治疗视网膜疾病研究提供有益线索。
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Expression profile of small RNA in rat Müller cells under oxidative stress
ZHANG Jie-ping1，2，3， ZHENG Li1，2，3， WANG Juan1，2，3， LV Li-xia1，2，3， XU Guo-tong1，2，3
(1. Tongji Eye Institute, Medical College， Tongji University， Shanghai 200092， China;2. Dept. of Regenerative Medicine, Medical College， Tongji University， Shanghai 200092， China;3. Stem Cell Research Center, Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China)
【Abstract】Objective To investigate the miRNA expression profile of rat Müller cells under oxidative stress. Methods Rat Müller cells were treated with 2mM of glyoxal for 48 h and total RNA was extracted. The small RNA library was generated by adding linkers to both ends of small RNA， reverse transcription， cloning and random sequencing. The sequences were subjected to Genebank Blastn and miRBase for sequence alignment analysis and Mfold online software for secondary structure prediction in order to screen out potential miRNAs. The results were finally confirmed by qRT-PCR. The signaling pathways related to discovered miRNAs were evaluated by miRPath. Results From this library， 163 clones were sequenced. 31 clones of them were known miRNAs， representing 13 families of miRNAs. They were closely related to PI3K-AKT pathway， MAPK pathway， extracellular matrix synthesis and interaction related pathway. A new miRNA sequence was found. Conclusion Highly expressed miRNAs of Müller cell under oxidative stress provide useful clues for better understanding its function in physiological and pathological context.
【Key words】oxidative stress; microRNA; Müller cell
doi：10.16118/j.1008-0392.2015.06.001
收稿日期：2015-05-13
基金项目：国家重点基础研究发展计划(2013CB967501)
作者简介：张介平(1976—)，女，讲师，博士研究生.E-mail： zhangjieping@tongji.edu.cn
通信作者：徐国彤.E-mail： gtxu@tongji.edu.cn
【中图分类号】R 571
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2015)06-0001-07
