表示，采用SPSS 11.5统计软件包处理数据。两组间IL-17数据比较采用配对t检验分析。P<0.01为差异有统计学意义。·基础研究·
【摘要】目的 研究非受体酪氨酸蛋白激酶Lck与IL-17在急性肺损伤(ALI)炎症反应中的表达及意义。方法 气管 内滴入盐酸法复制大鼠ALI模型，用免疫组织化学方法(IHC)检测肺组织中Lck和IL-17蛋白表达水平；Western印迹法检测肺组织匀浆中Lck蛋白的表达；用酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺组织匀浆和肺泡灌洗液(BALF)中IL-17的含量。结果 正常大鼠肺组织中Lck与IL-17低水平表达，ALI模型建立后6h，其表达显著增高，肺间质中阳性着色的单核细胞明显增多。与对照组比较，ALI组大鼠肺组织匀浆和肺泡灌洗液(BALF)中 IL-17含量均显著升高[(102.04±14.23)pg/mg provs. (25.16±9.08)pg/mg pro, P<0.01;(66.46±13.12)pg/mg pro vs. (8.19±2.54)pg/mg pro, P<0.01]。结论 ALI大鼠肺组织、肺泡灌洗液、匀浆中Lck与IL-17的表达均上调，两者参与了ALI的炎症反应过程。
【关键词】急性肺损伤; IL-17; 非受体酪氨酸蛋白激酶Lck; 大鼠
急性肺损伤(acute lung injury, ALI)的主要病理特征为多种炎性细胞参与的炎症反应，中性粒细胞是其中主要的炎性细胞。该细胞通过释放多种蛋白酶、超氧化物等在ALI发病中发挥重要作用[1]。细胞因子-17(Interleukin-17, IL-17)主要是由活化的Th17淋巴细胞分泌的细胞因子，它能刺激多种炎性细胞分泌IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白1等炎症介质，并增强细胞内黏附分子-1(Interlcellular adhesion molecule, ICAM-1)的表达，是中性粒细胞的一种特殊的激活物[2-3]。
非受体酪氨酸激酶Src家族中的Lck是在T细胞受体(T cell receptor, TCR)的信号转导中起关键作用的激酶[4]。在Lck激酶的作用下，引起胞内的一系列信号转导，最终使T细胞被激活[5]，分泌各种细胞因子、炎症介质、黏附因子，进一步激活其他免疫细胞，导致炎症反应。
在ALI的炎症反应过程中，Lck与IL-17的表达有什么变化及意义，目前尚无相关报道。本研究以ALI大鼠为研究对象，探讨Lck与IL-17在ALI的炎症反应过程中的变化及可能的作用机制。
1.1 主要试剂
小鼠IL-17 ELISA检测试剂盒(Diaclone公司),小鼠Lck抗体(ab18896， abcam公司)，小鼠IL-17抗体(ab79056， abcam公司)，RIPA细胞裂解液(P0013B，碧云天)。
1.2 动物模型制作和分组
健康成年SD大鼠20只(购自同济大学实验动物中心)，200～250g，随机分为盐酸吸入组10只，对照组10只。(1) 盐酸吸入组(ALI组): 大鼠以2%戊巴比妥钠腹腔内注射(40mg/kg)，麻醉满意后行气管切开插管固定，将盐酸(0.1mol/L，2ml/kg)滴入气道内并左右侧卧位各5min，观察大鼠呼吸频率变化、发绀情况。盐酸吸入后6h结束实验。(2) 对照组: 正常饲养，不做任何处理。
1.3 标本制作及检测指标
1.3.1 支气管肺泡灌洗(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 于实验结束后放血处死大鼠，开胸结扎右主支气管，用4℃生理盐水2ml反复灌注左主支气管并回抽，回收率60%～80%。将灌洗液在3000r/min转速下离心10min，离心半径12cm，上清液分装并保存在-20℃冰箱中待测。
1.3.2 Western Blot检测Lck蛋白 取称重量后的右上肺组织按照每100mg组织加RIPA蛋白裂解液1ml进行冰浴匀浆，充分匀浆后转移到预冷的4℃ EP管中。以4℃10000r/min进行低温离心20min，取上清液即为组织蛋白提取物。取5μg肺组织蛋白提取物进行12%SDS-PAGE，样品经SDS-PAGE分离后恒压60V转移3h；转移后的PVD膜浸入含3%脱脂奶粉的PBS-T中封闭2h；再将膜浸入1∶500稀释的兔抗大鼠Lck中，4℃过夜；洗膜3次，加1∶1500稀释的二抗，室温反应60min，洗涤后以DAB显色试剂盒显色，拍照。
1.3.3 组织病理学检测 各组大鼠均取右肺中叶，标本均经10%中性福尔马林充分固定，常规石蜡包埋，每个标本连续切片3张，一张做常规苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织的病理改变，对应的另两张分别做免疫组织化学，观察肺组织中Lck、IL-17的表达情况。切片厚度4μm。采用SP法免疫组织化学染色，一抗: 兔抗鼠Lck单克隆抗体，按1∶100稀释；一抗: 兔抗鼠IL-17多克隆抗体，按1∶100稀释。
1.3.4 肺组织匀浆液的制作 称取右下叶肺组织并捣碎，按质量: 体积比1∶9加4℃生理盐水，充分匀浆，3000r/min，离心10min，离心半径12cm，取上清液保存在-20℃冰箱中待测。
1.3.5 肺组织匀浆、BALF液中IL-17的测定 用同一方法对肺组织匀浆、BALF液做IL-17测定。小数肺组织、BALF液分别离心、收集上清液，以ELISA法检测细胞因子IL-17的含量。严格参照ELISA试剂盒说明书完成实验，在450nm处测吸光值。结果计算与判断: 所有OD值都应减除空白值后再行计算。以标准品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0ng/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应小鼠IL-17的含量。IL-17测定结果均以每毫克蛋白所含量表示 (pg/mg pro)。
1.4 统计学处理
实验数据以表示，采用SPSS 11.5统计软件包处理数据。两组间IL-17数据比较采用配对t检验分析。P<0.01为差异有统计学意义。
2.1 大鼠肺组织病理
对照组大鼠肺组织HE染色见支气管、肺组织结构完整，肺泡腔清晰，肺泡间隔无水肿及炎性细胞浸润等改变(图1A)。ALI组大鼠出现明显的肺损伤改变: 肺泡壁水肿、肺间质增厚和肺泡腔内有大量炎性细胞浸润，如嗜酸性粒细胞,淋巴细胞等，肺泡结构破坏(图1B)。
图1 大鼠肺组织HE染色；[A]正常对照组，[B]急性肺损伤组(×200倍)
Fig.1 H-E staining of rat lung tissues.[A] Normal control[B] acute lung injury(×200)
2.2 Lck免疫组织化学染色
对照组大鼠肺组织内有少量Lck表达，主要分布在小支气管、细支气管气道上皮组织中，见图2A。ALI组大鼠肺组织内Lck表达增高，主要分布在气道上皮组织、增厚的肺间质和被破坏的肺泡壁中，见图2B。
图2 大鼠肺组织Lck染色；[A]正常对照组，[B]急性肺损伤组(×200倍)
Fig.2 H-E staining of rat lung tissues.[A] Normal control[B] acute lung injury(×200)
2.3 IL-17免疫组织化学染色
对照组大鼠肺组织内有少量IL-17表达，主要分布在肺泡上皮细胞、肺间质内单核细胞，见图3A。ALI组大鼠IL-17表达明显增高，主要分布在增厚的肺间质单核细胞内，见图3B。
图3 大鼠肺组织IL-17染色；[A]正常对照组，[B]急性肺损伤组(×200倍)
Fig.3 IL-17 staining of rat lung tissues. [A] Normal control [B] acute lung injury(×200)
2.4 大鼠肺组织匀浆Lck蛋白的检测
Western Blot结果显示，与对照组相比较，ALI组大鼠肺组织匀浆中Lck表达明显上调，见图4。
图4 肺组织匀浆中Lck蛋白Western Blot检测结果
Fig.4 Western blotting results of Lck in lung homogenate
2.5 大鼠肺组织匀浆、BALF液中IL-17的检测
ALI组大鼠肺组织匀浆、BALF液中IL-17含量明显升高，与对照组相比较，结果有显著差异(P<0.01)，见表1、图5。
表1 肺组织匀浆及BALF中IL-17的含量
Tab.1 The level of IL-17 in lung homogenate and BALF
分类ALI组(n=10)对照组(n=10)tP肺组织匀浆102.03±14.23**25.16±9.087.4670.008BALF66.46±13.12*8.19±2.548.3820.009
注: IL白细胞介素，BALF肺泡灌洗液,ALI急性肺损伤。与对照组相比，*P<0.01,**P<0.01
图5 肺组织匀浆、BALF液中IL-17的检测结果柱状图
Fig.5 IL-17concentration in lung homogenate and BALF
ALI是由多种不同原因引起的肺泡上皮、肺泡毛细血管内皮和肺间质的急性弥漫性损害，以急性进行性加重的呼吸窘迫、难治性低氧血症和非心源性肺水肿为表现[6]。T淋巴细胞在肺的微循环中介导的免疫反应ALI病理组织学上的一项标志性改变，其不断释放氧自由基、蛋白酶及多种细胞因子，成为推动病变发生发展的重要环节[7]。
Th17细胞是近几年新发现的一类CD4+辅助性T细胞，在介导炎性反应、自身免疫性疾病、肿瘤和移植排斥等方面发挥重要作用。Th17细胞主要分泌IL-17(包括IL-17A、IL-17F)、IL-22、IL-23、IL-6、TNF-α等炎性介质和因子[8]。IL-17是Th17细胞分泌的主要细胞因子，其重要的生物学功能是促进多种细胞释放炎症因子而发挥着促进炎症反应的发生发展、免疫应答等功能[9]。目前Th17细胞参与ALI炎症反应的具体作用机制尚不清楚。有研究表明，IL-17可诱导嗜酸粒细胞活化，使其释放细胞因子和趋化因子CXCL1、CXCL8、CCL4而介导免疫反应[8]。IL-17与中性粒细胞的募集、活化密切相关，是联系T细胞与中性粒细胞的重要介质[10]。另外，IL-17可通过诱导支气管、肺泡内几种潜在的趋化因子，特别是IL-8的释放，间接趋化中性粒细胞在肺组织中的聚集和激活，参与气道炎症的反应过程[11]。在本研究中，肺组织匀浆及肺泡灌洗液中IL-17均增高,进一步证明了这一结论。但IL-17对中性粒细胞是否具有直接的刺激、激活作用，尚需进一步研究证实。
Lck是非受体酪氨酸蛋白激酶Src家族中的一员。在免疫防御过程中，Lck通过与TCR相互作用引起T淋巴细胞内的一系列信号转导，最终使T淋巴细胞被激活、成熟，向不同亚群分化，产生IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17等细胞因子，进一步激活其他免疫细胞释放各种炎症介质、黏附因子等，导致局部炎症反应[12]。因此，在T细胞的活化、成熟过程中Lck发挥着重要作用。本研究实验结果显示，ALI时肺组织中IL-17表达增高的同时，Lck的表达也增高，提示Lck也可能参与了Th17细胞的活化过程，促进Th17细胞释放细胞因子。
综上所述，本次研究以气管内吸入盐酸法制作大鼠ALI模型，发现ALI大鼠肺组织匀浆中Lck表达明显上调，并且肺组织匀浆、BALF液中IL-17含量明显升高，可以肯定在大鼠盐酸吸导致的ALI中IL-17是增高的，与国内其他学者的研究结果相近[8,12]。Lck与IL-17之间可能存在某种相关性，两者均参与了ALI的复杂病理过程，且相互作用，相互影响，加重了ALI的炎症反应。但是ALI是一个复杂的免疫防御过程，有多种免疫活性细胞参与发病过程，Lck与IL-17在其中的具体作用机制以及与其他免疫细胞的相互作用，需进一步的研究和探讨。随着对IL-17研究的不断加深，将促进人们对其效应功能更全面的认识，为ALI的发病机制和防治对策提供新的认识。
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The expression of non-receptor tyrosine protein kinase Lck andIL-17 in rats with acute lung injury
【Abstract】Objective To investigate the expression of non-receptor tyrosine protein kinase Lck and IL-17 in acute lung injury(ALI). Methods ALI was induced by inhalation of hydrochloric acid into trachea in rats. Immunohistochemistry was applied to detect the expression of Lck and IL-17 in lung tissue. The expression of Lck in lung homogenate was measured by Western blot. The concentrations of IL-17 in lung homogenate and bronchoveolar lavage fluid(BALF) were detected by ELISA. Results Lck and IL-17 were expressed at lower level in lungs of normal rats. The levels of Lck and IL-17 were significantly increased 6h after HCI inhalation. The increase of Lck and IL-17-positive mononuclear cells were also found in lung interstitium. The IL-17 levels in lung tissue homogenate and in BALF were higher in ALI group than those in control group [(102.04±14.23)pg/mg provs. (25.16±9.08)pg/mg pro, P<0.0l;(66.46±13.12)pg/mg pro vs.(8.19±2.54)pg/mg pro,P<0.0l]. Conclusion The expression of Lck and IL-17 in lung tissue and BALF is up-regulated in ALI rat, indicating that both may be in the inflammatory response of ALI.
【Key words】acute lung injury； IL-17; no receptor tyrosine protein kinase Lck; rat
doi：10.16118/j.1008-0392.2015.03.006
收稿日期：2014-11-07
【中图分类号】R 561.4
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2015)03-0027-04