±s表示，多组数据的比较采用方差分析(ANOVA)，多组间的两两比较使用最小显著差法(LSD法)，两组比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。·基础研究·
【摘要】目的 观察不同雌、孕激素水平对子宫内膜上皮细胞Claudin-4表达的影响。方法 RL95-2细胞系培养于含10%胎牛血清培养基中，在培养基中加入雌、孕激素，一组孕酮的浓度恒定为0.025μmol/L，雌二醇终浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0nmol/L；另一组雌二醇的浓度恒定为0.25nmol/L，孕酮终浓度分别为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625和0μmol/L。两组分别培养24、48和72h，RT-PCR和Western印迹法检测RL95-2细胞的Claudin-4基因和蛋白表达。结果 在雌激素恒定的条件下，RL95-2细胞的Claudin-4基因和蛋白表达随着孕激素水平的升高而升高(P<0.01)，随着培养时间的延长，其表达Claudin-4基因和蛋白水平升高(P<0.01)。在孕激素恒定的条件下，RL95-2细胞的Claudin-4基因和蛋白表达随着雌激素水平的升高而降低(P<0.01)，随着培养时间的延长，其表达Claudin-4基因和蛋白水平降低(P<0.01)。结论 Claudin-4在子宫内膜细胞的表达水平与雌孕激素的水平具有密切的联系，Claudin-4可能参与子宫容受性的形成和胚泡在子宫的着床有关。
【关键词】雌激素； 孕激素； 紧密连接； 子宫内膜
胚泡在子宫着床的过程中，子宫内膜起到关键性的作用，寻找合适的子宫容受性指标成为临床医师十分关切的问题之一[1]。紧密连接蛋白复合物是维持细胞离子和溶质细胞间渗透的主要物质，其主要成分为紧密连接蛋白Claudins[2]，近年来的研究表明Claudin-4在子宫内膜的种植窗其表达明显上调，故认为Claudin-4在子宫的容受性形成和子宫着床等方面具有重要作用，可能成为子宫容受性和子宫内膜种植窗期的标志物[3]。本研究通过体外模拟孕激素和雌激素水平的生理性变化，观察子宫内膜细胞的Claudin-4表达，旨在观察Claudin-4在子宫内膜的表达及其与子宫内膜容受性的形成和胚泡着床的关系，为Claudin-4是否可以成为子宫内膜容受性标志物提供实验依据。
1.1 试剂
雌激素、孕激素、无酚红DMEM/F12培养基均购自美国Sigma公司；子宫内膜上皮细胞(RL95-2)购自中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection， CCTCC)；胎牛血清(FBS)由杭州四季青生物制剂有限公司提供；TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司；DNA酶I购自美国Fermentas公司；TagDNA聚合酶及反应缓冲液购自武汉博士德股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和分组 用10%FBS的DMEM/F12(1∶1，含0.005mg/ml胰岛素)培养基中培养RL95-2细胞，其培养条件为维持在5%CO2和37℃恒温。将指数生长的RL95-2细胞制备成浓度为1×104/ml，按照190μl/孔的方法将细胞接种到96孔的培养板上，经过24h培养后，将RL95-2细胞接种到16个60mm培养皿中,待细胞生长至汇合时,分别加入雌二醇和孕酮。一组孕酮的浓度恒定为0.025μmol/L，雌二醇终浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0nmol/L。另一组雌二醇的水平保持在0.25nmol/L，孕酮浓度分别为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625和0μmol/L。生长24、48、72h分别收获细胞，每组设1个阴性对照。
1.2.2 RT-PCR检测Claudin-4的mRNA表达 内标基因选择GAPDH，上游引物序列： 5′-ACCGCAAAGACTGTGGATGC-3′，下游引物序列： 5′-TGAGCTTGACAAAGTGGTCG-3′，其产物大小为546bp，Claudin-4上游引物序列： 5′-GTGCCTTG-CTCACCGAAAC-3′，下游引物序列： 5′-CCACCAC-TGCCCAAACCT-3′，目标片段的大小为137bp。采用总RNA提取试剂TRIzol提取各组处理后RL95-2细胞的总RNA；取1μl总RNA、AMV反转录酶0.5μl进行反转录；取cDNA 2.5μl为模板，分别加入0.1μl聚合酶Ex Taq HS，0.1μl上游和下游的引物，将上述物质进行混合和反应。94℃预变性 2min，及40s的变性，在温度为50～65℃的条件下40s的退火，和时间持续为1min在72℃温度条件下的延伸，总共循环进行35个。将PCR产物在-20℃ 的冰箱条件下进行保存。每组均以GAPDH作为内参照，同样条件下分管进行扩增。取6μl PCR产物，在电压120V，电流100mA的条件下2%琼脂糖凝胶电泳30min。电泳结束时，将凝胶放置在EB液中5min后，将凝胶取出。结果判定： 电泳条约逾期大小片段大小一致为阳性 RT-PCR 片段。应用Quantity One software(Bio-Rad Inc)分析电泳结果进行灰度扫描和分析。以目的基因片段的灰度值与GAPDH的灰度比值来表述目的基因mRNA产物的相对表达量。
1.2.3 Western印迹法检测Claudin-4的蛋白表达 提取各组处理后RL95-2细胞蛋白，将各组的蛋白加入到12%的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，80V的电压条件下进行电泳，再用120V电压的条件下进行电泳至样品距凝胶下端1cm左右。用甲醇对PVDF膜进行浸泡5min，然后用缓冲液(主要由20%甲醇，25mmol/L Tris-HCl和 192mmol/L 甘氨酸组成，最终pH值为8.3，)浸泡10min后，并将凝胶上的蛋白质通过电转移的方式转移印迹到PVDF膜上，在120V电压的条件下总共转移的时间为70min。在4℃用5%FBS在PVDF膜进行封闭。先用1∶2000的Claudin- 4一抗，在室温的条件下反应1h，用0.05%吐温20 PBS液对PVDF膜进行清洗，每次10min，共进行3次。然后用1∶8000的山羊抗人IgG二抗，在室温的条件下3h，再用0.05%吐温20PBS液进行洗膜，每次洗膜 10min，清洗3次。ECL试剂显色： 将等比例的ECL试剂盒中的A和B液，分别与膜进行反应 1min，并通过凝胶成像系统进行显影，并进行拍摄照片。结果用 ImageJ 1.44对胶片扫描并进行平均密度值(average density values， ADV)测定，与GAPDH的比值作为各组产物相对吸光度值。
1.3 统计学处理
正态分布的计量资料数据采用±s表示，多组数据的比较采用方差分析(ANOVA)，多组间的两两比较使用最小显著差法(LSD法)，两组比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 孕激素对RL95-2细胞Claudin-4基因和蛋白表达的影响
在雌激素恒定的条件下，RL95-2细胞的Claudin-4基因和蛋白表达随着孕激素水平的升高而升高(P<0.01)，随着培养时间的延长，其表达Claudin-4基因和蛋白水平升高(P<0.01)，见图1、2。
图1 不同浓度孕激素对 RL95-2细胞 Claudin-4基因表达的影响
Fig.1 The expression of Claudin-4 mRNA in RL95-2 cells with different concentrations of estrogen
图2 不同浓度孕激素对 RL95-2细胞 Claudin-4蛋白表达的影响
Fig.2 The expression of Claudin-4 protein in RL95-2 cells with different concentrations of estrogen
2.2 雌激素对RL95-2细胞Claudin-4基因和蛋白表达的影响
在孕激素恒定的条件下，RL95-2 细胞的Claudin-4基因和蛋白表达随着雌激素水平的升高而降低(P<0.01)，随着培养时间的延长，其表达Claudin-4基因和蛋白水平降低(P<0.01)，见图3、4。
图3 不同浓度雌激素对 RL95-2细胞 Claudin- 4基因
表达的影响
Fig.3 The expression of Claudin- 4 mRNA in RL95-2 cells with different concentrations of progesterone
图4 不同浓度雌激素对 RL95-2细胞 Claudin- 4 蛋白表达的影响
Fig.4 The expression of Claudin- 4 protein in RL95-2 cells with different concentrations of progesterone
细胞黏附方式有多种，紧密连接为重要的一种，主要存在内皮细胞和上皮细胞形成的复合体中，主要功能是调控离子或者溶质的扩散作用，起到从细胞一侧向另一侧的屏障，同时紧密连接在细胞的顶侧，可以防止细胞基底部成分与顶侧成分的混合，决定了内皮细胞的极性，并对细胞的运动、增殖和分化等具有重要的调节作用[4-5]。紧密连接主要由膜蛋白和胞浆蛋白组成，其中膜蛋白主要为Claudin、Occludin和黏附分子[6]。Claudin是旁细胞转运的决定因子，其介导转运主要与分子大小和电荷具有明显的相关性。当Claudin在细胞出现异常表达时，出现内皮和上皮细胞出现结构和功能紊乱，甚至导致损害，可能参与了多种疾病发生和发展。
Claudin蛋白为多基因家族，有24个家族成员，Claudin-4是该家族最重要的家族成员之一，定位在染色体7q11.23，由209个氨基酸组成，主要存在于小肠、结肠，脑，肾和子宫内膜等[7]。Claudin-4与其他成员一样，具有4个疏水区，2个细胞外的环状结构和胞质中的氨基酸和羧基组成，由于羧基端具有磷酸化作用的位点，当羧基端发生磷酸化时，对Claudin蛋白的紧密连接复合体具有显著的调节作用。磷酸化参与紧密连接的调节，其作用的靶向位点： 肌动蛋白和肌球蛋白，肌球蛋白和肌动蛋白连接定位于从底部到顶部的连接复合物，肌球蛋白的结构收缩可以对紧密连接膜产生离心性的牵引作用，从而起到调节紧密连接的渗透性[8]。近年来，学者们发现胚胎滋养层细胞中有Claudin-4的表达，当Claudin-4受到抑制时，小鼠的滋养层细胞的屏障功能受到破坏，而且导致胚泡的形成受到显著的抑制，从而导致小鼠的胚胎的形成受到明显的抑制[9]，故认为Claudin-4与胚泡的形成具有明显的联系。
近年来学者们通过基因芯片技术筛选与子宫容受性基因，发现Claudin-4在子宫内膜种子期表达量明显上调，表明Claudin-4可能在子宫内膜容受期具有重要作用，可能成为子宫内膜容受期的特异性指标[10]。本组研究表明在雌激素恒定的条件下，RL95-2细胞的Claudin-4基因和蛋白表达随着孕激素水平的升高而升高，随着培养时间的延长，其表达Claudin-4基因和蛋白水平升高；在孕激素恒定的条件下，RL95-2细胞的Claudin-4基因和蛋白表达随着雌激素水平的升高而降低，随着培养时间的延长，其表达Claudin-4基因和蛋白水平降低。与文献报道结果类似： 正常生育妇女的子宫内膜在增殖期到分泌期，Claudin-4表达逐渐增加，到分泌中期Claudin-4表达出现高峰，分泌晚期表达降低。目前的研究发现子宫的容受期仅仅为排卵后的6～10d，此时子宫内膜出现最大的胚泡种植的容受性。Claudin-4的高表达与子宫内膜容受期一致，即与子宫内膜的雌孕激素的水平变化一致，提示Claudin-4参与了子宫内膜的容受期，故可以认为Claudin-4表达水平的增加有利于胚泡黏附和植入，在胚胎着床的过程中发挥重要的作用。现有文献支持Claudin-4 参与了肿瘤细胞的侵袭和转移，并与肿瘤的分化和黏附有关[11-12]，故Claudin- 4是否在胚泡在子宫内膜定位和黏附，是否与穿透上层基底层的连接细胞和内膜基质等需要进一步的研究。
总之，Claudin-4在子宫内膜细胞的表达水平与雌孕激素的水平具有密切的联系，Claudin-4可能参与子宫容受性的形成和胚泡在子宫的着床有关。
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Correlation of estrogen and progesterone levels with Claudin-4 expression in endometrial epithelial cells
【Abstract】Objective To investigate the association of estrogen and progesterone levels with Claudin-4 expression in endometrial epithelial cells. Methods Endometrial epithelial RL95-2 cells were cultured in 10% FBS-containing medium, and different concentrations of estrogen and progesterone were added into the culture medium. When the concentration of progesterone maintained at 0.025μmol/L, the final concentrations of estradiol were 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 and 0nmol/L; or when the estradiol concentration maintained at 0.25nmol/L, the final concentration of progesterone were 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 and 0μmol/L, RL95-2 cells were cultured for 24h, 48h and 72h, respectively, the expression of Claudin-4 mRNA and protein was detected by RT-PCR and Western blotting. Results Under constant concentration of estrogen, the expression of Claudin-4 mRNA and protein in RL95-2 cells was increased as the progesterone levels increased or as the culture time was elongated(P<0.01). Under constant conditions of progesterone, the expression of Claudin-4 mRNA and protein was decreased in RL95-2 cells as estrogen levels increased or as the culture time was elongated(P<0.01). Conclusion The expression of Claudin-4 in endometrial epithelial cells is closely correlated with estrogen and progesterone levels, indicating that Claudin-4 may be involved in the formation of uterine receptivity and embryo implantation.
【Key words】estrogen; progesterone; closely connection; endometrial
doi：10.16118/j.1008-0392.2015.02.011
收稿日期：2014-10-20
基金项目：上海市卫生局项目(2011Y059)
【中图分类号】R 711
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2015)02-0045-04