表1 研究对象的一般资料比较
Tab.1 Comparison of general data between two groups of patients
组 别年龄/岁孕周/周胎盘早剥组26.02±10.1532.32±6.65正常妊娠组27.18±9.8832.28±8.25P值>0.05>0.05
·基础研究·
【摘要】目的 探讨外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中NF-κB活化与TNF-α表达在胎盘早剥中的意义。方法 以62例胎盘早剥患者为研究对象、正常孕产妇62例为对照组，Western印迹法 测定PBMCs中NF-κB蛋白表达水平，RT-PCR检测血清TNF-α mRNA值的变化，并记录新生儿Apgar评分，进行相关性分析。结果 与对照组相比，胎盘早剥患者PBMCs NF-κB表达升高(P<0.05)，TNF-α水平升高(P<0.05)，两指标之间呈显著正相关(P<0.01)，与新生儿Apgar评分呈负相关(P<0.05)。结论 NF-κB和TNF-α参与了胎盘早剥 病理生理过程，提示胎盘早剥与炎症反应密切相关。
【关键词】胎盘早剥； 核因子-κB； 肿瘤坏死因子-α
妊娠20周后或分娩期，正常位置胎盘在胎儿娩出前部分或全部从子宫壁剥离，这就是胎盘早剥[1]。胎盘早剥是妊娠晚期的严重并发症，是产前出血的原因之一，起病急、进展快，严重威胁母儿生命，其围产儿死亡率、窒息等不良结局明显高于正常妊娠。
研究发现妊娠患者血清中多个炎症因子表达升高，包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6， IL-6)等， 它们在妊娠高血压、妊娠糖尿病等妊娠期疾病的发病中起重要作用。核因子-κB(nuclear factor kappa B， NF-κB)是机体炎症通路中重要的核转录因子，甚至起到核心作用， NF-κB可以被诸多促炎因子激活，继而上调多种炎症细胞因子的表达，体外和动物实验证实 NF-κB通路的活化与全身炎症反应综合征密切相关， TNF-α作为促炎因子在通路中起重要作用[2-3]。
本研究检测了胎盘早剥孕妇外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells， PBMCs)中NF-κB、血清TNF-α表达水平的变化，初步探讨NF-κB、TNF-α表达与胎盘早剥新生儿Apgar评分的关系。
1.1 研究对象
2008年1月至2014年10月云南省第三人民医院行剖宫产患者3821例，其中发生胎盘早剥71例，发生率为1.86%。本研究选择产前超声检查和术后胎盘标本病理均确诊的病例62例进行研究，彩超检查见到胎盘后血肿或胎盘增厚则确诊，9例病理证实但B超未发现故未纳入研究予以排除。胎盘早剥组平均年龄(26±10.15)岁，其中初产妇39例，发病平均在孕(32±6.65)周，对照组根据研究组选择，即每发生1例胎盘早剥，则选择与之孕周相同的无合并症孕妇作为对照，同时抽血备检，两组年龄、孕周差异无统计学意义，见表1。
表1 研究对象的一般资料比较
Tab.1 Comparison of general data between two groups of patients
组 别年龄/岁孕周/周胎盘早剥组26.02±10.1532.32±6.65正常妊娠组27.18±9.8832.28±8.25P值>0.05>0.05
1.2 一般指标
本组患者临床表现为腹痛伴有阴道流血49例，胎心监护异常12例，阴道血性羊水1例。胎盘早剥严重程度分为三度： (1) Ⅰ度，剥离面积少，症状不明显；(2) Ⅱ度，胎盘剥离面积1/3左右，腹痛症状明显；(3) Ⅲ度胎盘剥离面积超过1/2，腹痛等临床表现较Ⅱ度重。本组资料中Ⅰ度胎盘早剥45例，Ⅱ度12例，Ⅲ度5例。新生儿评价采用1min Apgar评分，总分8～10分为无窒息，4～7分为轻度窒息，0～3分属重度窒息。
1.3 PBMCs的分离
超声诊断胎盘早剥的患者，即用灭菌肝素抗凝的试管肘静脉抽取血5ml，用密度梯度离心法分离PBMCs，一半用来提取蛋白检测NF-κΒ，另一半用来提取RNA检测TNF-α表达。
1.4 Western印迹法检测PBMCs中NF-κB 蛋白表达
碧云天公司购置细胞裂解液及核蛋白抽提液，按照说明书离心收集备用的PBMCs，提取核蛋白并定量，行SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳，依次电转、封闭、一抗孵育过夜、洗膜、二抗、洗膜、混合发光液、孵育、曝光，应用Bio-Best凝胶成像分析系统采集图像，图像采用生物医学图像分析系统进行分析处理，以条带的吸光度值表示蛋白含量。蛋白的相对表达量采用目的条带和内参照β-actin条带的比值来记录。
1.5 RT-PCR检测TNF-αmRNA表达
应用TRIzol法提取PBMCs中的总RNA， TNF-α上游引物序列： 5′-CTT CTC CTT CCT GAT CGT GG-3′，下游引物序列： 5′-GCT GGT TAT CTC TCA GCT CCA-3′。内参照选择 GAPDH，RT-PCR反应条件： 94℃变性1min，60℃ 退火 2min，72℃延伸1min，循环36次。PCR产物行凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯照射下拍照，采用图像分析系统对 电泳带进行分析，进行光密度值测定，以光密度的 比值反映TNF-αmRNA 相对表达。
1.6 统计学处理
用SPSS 13.0软件进行数据统计分析，以
s表示计量资料，采用方差分析(One-way ANOVA)来比较符合正态分布的多组间数据，两变量相关性采用Pearson相关分析进行分析，不符合正态分布的数据秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。
胎盘早剥组发病诱因中胎膜早破9例，外伤2例，性生活诱发早剥1例，不明诱因50例，其中有3例误诊为先兆早产入院保胎治疗，保胎过程中通过反复彩超检查确诊为胎盘早剥。
胎盘早剥组TNF-αmRNA和NF-κB水平较对照组表达明显增高，差异有统计学意义 (P<0.05，P<0.01)，见图1、图2。对患者 NF-κB蛋白表达水平与TNF-α mRNA等进行Pearson相关分析，提示胎膜早剥组 NF-κB水平与 TNF-α mRNA表达呈正相关 (r=0.651，P<0.01)，Apgar评分与 NF-κB水平呈负相关 (r=0.535，P<0.05)，和 TNF-α mRNA呈负相关 (r=0.599，P<0.05)，与孕周无明显相关性，见表2。
图1 TNF-α cDNA电泳
Fig.1 Electrophoregram of TNF-α cDNA 1、3： 胎盘早剥组；2： 正常妊娠组；M： Marker
图2 Western印迹法检测PBMCs中NF-κB蛋白的表达
Fig.2 Expression of NF-κB protein detected by Western blotting 1、2： 胎盘早剥组；3： 正常妊娠组；M： Marker
表2 NF-κΒ和TNF-α mRNA在胎盘早剥组与 正常妊娠组的表达
Tab.2 Expression of NF- κB and TNF-α in placenta abruption patients and normal pregnancy group
±s)
组 别孕周/周Apgar评分NF-κΒTNF-αmRNA胎盘早剥组32.32±6.654.82±4.051.85±0.540.45±0.12正常妊娠组39.16±2.329.41±0.971.02±0.340.12±0.06P值<0.05<0.05<0.05<0.01
NF-κB为调节细胞基因转录的关键因子，PBMCs中也存在 NF-κB炎症通路， NF-κB信号通路是炎症反应调节的核心环节，炎症参与了胎盘早剥的发展过程， NF-κB激活后转移入细胞核，和多种炎症因子启动子区域共同参与黏附分子、炎症介质等的转录过程，而 NF-κB炎性通路的改变可能进一步扩大炎症反应，甚至发生全身炎症反应综合征。本研究发现胎盘早剥患者PBMCs中 NF-κB活性明显增高，并伴 TNF-α表达增加，提示NF-κB炎性通路参与了该病理过程，说明胎盘早剥中也存在着 TNF-α的转录翻译以及NF-κB的激活通路。
本研究通过探讨胎盘早剥患者PBMCs中NF-κB的活化及其与 TNF-α表达间的关系，分析 TNF-α表达、NF-κB活化在胎盘早剥中与Apgar评分的关系。结果提示胎盘早剥患者PBMCs中NF-κB蛋白的表达水平较正常妊娠组高，新生儿Apgar评分和PBMCs NF-κB水平负相关，表明新生儿状况与炎症状态有关。研究已证实活化的NF-κB核定位序列暴露并发生核移位，与细胞核内DNA上特异κB序列结合，并且启动靶基因的转录，靶基因包括了对细胞的活化、分化起调控作用的 TNF-α、黏附分子等的转录。本研究显示，患者 PBMCs TNF-α mRNA与 NF-κB水平表达较对照组显著升高， TNF-α mRNA的水平与NF-κB的表达正相关。NF-κB表达和 TNF-α mRNA均与Apgar评分呈负相关，说明 TNF-α mRNA表达增强与 NF-κB活化有关，二者互相作用，从而推动病理过程进展。
国内报道产妇胎盘早剥新生儿死亡率较高，高达20%～35%。引起胎盘早剥的原因尚未完全明确，其中常见的诱因主要有高血压疾病、胎膜早破等[4-5]。胎盘早剥诊断需要结合病史、临床症状、体征、辅助检查综合分析作出诊断。本组资料中62例产前检查彩超提示胎盘后壁血肿或胎盘增厚，术中发现胎盘早剥并进一步确诊。胎盘早剥引起产妇出血、新生儿供血不足危及母婴生命，母婴预后与及时恰当的处理密切相关。胎儿娩出前胎盘早剥有可能继续加重，对于Ⅱ度和Ⅲ度胎盘早剥建议早行剖宫产术终止妊娠。胎盘Ⅰ度早剥患者，一般情况稳定，胎监正常，病情较轻，宫口已扩张，以外出血为主，预计短时间可以结束分娩，可经阴道分娩。对于Ⅱ度、Ⅲ度者，不论胎儿存活与否，如不具备阴道分娩条件，应立即选择剖宫产终止妊娠。除了上述影响因素，炎症因子也应该成为研究胎盘早剥的重要靶因子。
对于胎盘早剥孕产妇，需要临床医生早期识别，与前置胎盘、先兆早产等鉴别，反复检查、严密观察，增加胎儿监测，同时加强包括NF-κB和 TNF-α炎症因子的检测。本研究通过检测胎盘早剥时产妇炎症因子NF-κB和 TNF-α变化与Apgar评分负相关的关系，发现在胎盘早剥过程中，促炎症因子 NF-κB和 TNF-α过表达，并且与新生儿状态密切相关。本研究观察了胎盘早剥对产妇的影响，在此过程中，其他相关的因素也参与了胎盘早剥的病理生理过程，包括蛋白C、血栓调节素、胎盘蛋白等，上述因素和胎盘早剥的因果关系需要进一步深入研究[6-8]，有研究提示亚临床甲状腺功能减退、新生儿畸形等也参与了胎盘早剥的病理过程[9]。阻断这一通路可能给胎盘早剥的治疗带来新的机会，它的作用机理是阻断了炎症的“瀑布样”作用。目前已经发现的 p38 MAPK抑制剂和吡咯烷二硫氨基甲酸酯 (pyrrolidine dithiocarbamate， PDTC)等作为 NF-κB 信号炎症通路的阻断剂和拮抗细胞因子拮抗剂，其临床应用需要进一步广泛研究，尤其是在孕产妇体内的应用更加需要深入研究。
综上所述， NF-κB细胞信号转导通路及 TNF-α 参与了胎盘早剥的发生、发展，并与新生儿结局相关，通路中包括了 TNF-α和 IL-1、IL-6等炎症因子的相互作用[10-12]。通过靶向药物来高选择性抑制 NF-κB激活，下调相关基因的活化，这些可能途径为抑制炎症介质的过度激活提供了新的思路，这样通过对于炎症通路的干预来影响胎盘早剥的恶化，这些研究具有重要的理论意义，在临床工作中可能发挥重要作用。
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Expression of NF-κB and TNF-α in peripheral blood mononuclear cells of patients with placental abruption
【Abstract】Objective To investigate the expression of nuclear factor kappa B(NF-κB) in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in patients with placental abruption. Methods The study comprised 62 placental abruption patients and 62 healthy pregnant women. The expression of NF-κB in PBMCs was detected by Western blotting and TNF-α mRNA was detected by RT-PCR. The association between expression of NF-κB, TNF-α and Apgar scores was analyzed. Results Compared to the controls, the expression of NF-κB protein and TNF-α mRNA was significantly increased and Apgar scores were decreased in placental abruption patients(allP<0.01). The expression of NF-κB was positively associated with TNF-α concentration and the Apgar scores were negatively correlated with the expression of NF-κB and TNF-α(P<0.05). Conclusion Placental abruption patients have increased NF-κB and TNF-α expression, which may be related to placental abruption and inflammation.
【Key words】placental abruption; nuclear factor kappa B; tumor necrosis factor-α
doi：10.16118/j.1008-0392.2015.02.010
收稿日期：2014-12-21
【中图分类号】R 714.4
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2015)02-0041-04