±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。·基础研究·
【摘要】目的 建立大鼠失血性休克复苏模型，观察肉苁蓉总苷(cistanche total glycosides， CTG)对缺血再灌注肾损伤的保护作用。方法 将SD大鼠随机分为3组： 假手术组、实验组(休克复苏组)、CTG处理组，每组各10只。实验组和CTG处理组建立肾缺血-再灌注模型，治疗组大鼠给予CTG 400mg/kg腹腔注射，实验组和假手术组注射生理盐水。分别检测各组血肌酐含量、尿素氮含量、胱抑素C以测定肾功能，流式细胞分析技术检测肾脏细胞凋亡率；酶联免疫法(ELISA)检测大鼠肾组织X-染色体连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein， XIAP)表达。结果 CTG组与实验组比较，血Cr、BUN和胱抑素C均明显降低(P<0.01)，肾脏细胞凋亡减少(P< 0.05),CTG可显著提高XIAP的表达(P<0.05)。结论 肉苁蓉总苷对大鼠缺血再灌注肾损伤具有保护作用，可能与促进XIAP的表达有关。
【关键词】肾； 缺血再灌注损伤； 肉苁蓉总苷； 染色体连锁凋亡抑制蛋白； 细胞凋亡； 大鼠
缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤是失血性休克、严重创伤及肾移植、肾肿瘤手术等过程常见的肾功能损害的病理生理现象。研究表明细胞凋亡是I/R损伤所致的肾功能损伤的重要环节[1]。X-染色体连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein， XIAP)是迄今发现的最强的内源性凋亡抑制因子之一[2]。有关XIAP在I/R损伤后肾组织的抗凋亡研究较少。肉苁蓉总苷(cistanche total glycosides， CTG)是从列当科植物肉苁蓉中提取分离出来的苯乙醇苷类化合物,生物功能多样，有关它在I/R损伤后的肾保护作用的研究尚少。本研究通过建立大鼠失血性休克复苏模型，建立全身性I/R损伤模型，探讨肉苁蓉总苷预处理对I/R损伤肾脏的保护作用并探讨其可能的作用机制。
1.1 动物及分组
由上海中医药大学实验中心提供的清洁级健康雄性大鼠30只，体质量(320±30)g。随机分为3组： 假手术组、实验组(休克复苏组)、CTG组，每组各10只。
1.2 主要试剂和仪器
肉苁蓉总苷(批号： 20081516)购自浙江杭州杏辉天力药业有限公司；戊巴比妥钠、Hoechst 33258、碘化丙啶,购自美国Sigma公司；鼠X染色体连锁凋亡抑制蛋白测定试剂盒(XIAP)、ELISA Kit购自上海科敏生物科技有限公司；酶标仪购自美国Thermo公司；多参数生理检测仪购自日本Nihon Kohden公司；流式细胞仪 BDFACSAria购自美国Becton-Dilkinson公司；24G套管针购自山东洁瑞医疗器械公司。
1.3 实验方法
1.3.1 动物模型的制备 SD大鼠实验前12h禁食，戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定，左下腹部作3cm的切口，分离股动脉，置入24G的套管针，连接多参数生理检测仪，测得大鼠平均血压为(113±15)mmHg，20ml 注射器肝素化接三通器放血，血压降至40mmHg(1mmHg=0.133kPa),认为休克开始，维持该血压90min，放血量为(13±3)ml，然后将注射器内的自体血缓慢回输，需要30min左右,血压恢复至基础值的90%以上，认为复苏成功[3]。将套管针拔出，结扎股动脉，缝合切口。待大鼠清醒后放回饲养笼观察，自由进食水。在复苏后24h用戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉、剖腹，下腔静脉采血5ml，立即处死大鼠，取出左右双侧肾脏备用。
1.3.2 用药方法 CTG处理组在大鼠放血前2h给予CTG，按400mg/kg的剂量注入腹腔。实验组放血前2h予3ml生理盐水腹腔注射；假手术组仅行麻醉、剖腹和分离股动脉置套管针以及缝合切口等，不行放血以及复苏，其余同实验组。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 血BUN、Cr、胱抑素C含量的测定 其抑胱素C是一种肾小球滤过率变化的内源性标志物,当肾功能受损时，肾小球滤过率下降，胱抑素C在血液中浓度可增加10倍，胱抑素C的诊断准确性明显优于血清肌酐。血BUN、Cr、胱抑素C含量交本院检验科测定。
1.4.2 细胞凋亡率测定 流式细胞仪检测肾脏细胞凋亡率。取肾脏用刀片切碎，加少许PBS移入试管中。加入0.3%胰蛋白酶在37℃水浴箱中消化，孵育20min，待试管内物质变浑浊即加2倍的PBS以终止消化，用300目尼龙网过滤，弃去杂质，以低温离心机离心，离心半径8cm，12000r/min，离心5min，弃去上清液，调细胞浓度为1～1.5×106/ml，取以上细胞悬液0.4ml，加入1.2ml Hoechst 33258(10μl/ml),避光37℃水浴箱孵育，试管加盖，5min 后加PBS漂洗，离心半径8cm，12000 r/min，离心 5min，弃去上清液，同法再漂洗1遍。加PI 0.4ml,染色5min后上机检测肾脏正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞的百分率。依据各类细胞对此两种染料的亲和力得知： 仅有PI着色的为死亡细胞，仅有Hoechst 33258着色的为凋亡细胞，两者均不着色的为正常活细胞。
1.4.3 酶联免疫法(ELISA)检测大鼠肾组织内XIAP表达 取各组肾脏，用组织裂解液处理新鲜肾组织。低温离心机12000r/min离心5min，取上清按XIAP ELISA Kit试剂盒说明书操作，由上海交大丰核科技有限公司负责检测。
1.5 统计学处理
各组实验数据用±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。
肾脏功能指标Cr、BUN和胱抑素C值3组间差异均有统计学意义(P<0.01)；实验组较假手术组均明显升高(P<0.01)，说明大鼠肾脏I/R模型制备成功；CTG组与实验组比较，Cr、BUN和胱抑素C值均明显降低(P<0.01)。肾脏细胞凋亡率： 假手术组肾脏组织只有极少数细胞发生凋亡，凋亡细胞占0.42%±0.08%，实验组细胞凋亡明显增多，占18.22%±5.32%(P<0.01)，CTG组与实验组比较，细胞凋亡数减少,为12.71%±3.81%(P<0.01)。CTG对I/R损伤肾组织XIAP表达的影响： 假手术组仅有较微弱的XIAP的表达，实验组XIAP表达显著增加，(P<0.01)。与实验组比较，CTG组可显著提高XIAP的表达(P<0.05)，见表1。
表1 各组大鼠肾脏功能指标Cr、BUN和胱抑素-C值
Tab.1 Renal function indexes in three groups
组别BUN/(mmol·L-1)Cr/(mmol·L-1)胱抑素C/(mg·L-1)凋亡细胞率/%XIAP/(μg·L-1)假手术组1.18±0.2365.1±6.200.78±0.110.42±0.080.125±0.013实验组4.53±0.41*131.4±12.7*2.23.±0.63*18.22±5.32*0.435±0.029*CTG处理组2.37±0.59#81.3±5.71#1.10±0.21#12.71±3.81#0.652±0.031△
与假手术组相比，*P<0.01；与实验组相比，△P<0.05，#P<0.01
缺血再灌注肾损伤的机制十分复杂，是多种因素作用下通过许多途径发生的病理过程，诸如钙离子超载、脂质过氧化损伤、细胞凋亡和坏死等，其中caspase依赖的细胞凋亡是I/R肾脏损伤诱导的肾小管上皮细胞损坏的主要形式之一[4]。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein， IAP)家族是至今发现的哺乳类细胞中唯一的内源性半胱天冬酶(caspase)抑制物，能有效阻止细胞凋亡的发生。XIAP是IAP家族中对caspase抑制作用最强的成员，可抑制多种病理刺激引起的细胞凋亡，对损伤器官起到保护作用[5]。
目前肾I/R损伤动物模型的建立方法多为切除一侧肾脏，夹闭另一侧肾蒂或肾动脉[6]，模拟肾移植的状态。本研究采用的是失血性休克/复苏模型，更加接近临床的创伤休克时出现的全身性缺血再灌注的病理生理过程，本实验中，SD大鼠的血BUN、Cr、胱抑素C量显著提高，肾功能严重受损，是较理想的研究I/R肾损伤等的动物模型。
CTG是中药肉苁蓉的重要药用成分,肉苁蓉，性温，味甘、咸，归肾、大肠经，始载于神农本草经。《本经》： 主五劳七伤，补中，养五脏，强阴，益精气；《本草汇言》： 肉苁蓉，养命门，滋肾气，补精血之药也。肉苁蓉在我国使用已有两千年，在历代增力配方中居第1位，在滋补配方中仅次于人参居第2位，研究表明肉苁蓉具有提高性功能，调节神经内分泌，提高机体免疫功能，抗氧化，促进物质代谢，保护缺血心肌等多种功能。作为肉苁蓉主要药用成分，CTG的作用是多方面的。在脑缺血再灌注模型研究发现，CTG能够降低缺血再灌注后脑组织的兴奋性氨基酸对SD大鼠脑组织起到保护[7]。CTG对小鼠组织有抗氧化作用，对小鼠急性脑缺氧和小鼠心肌损伤有一定保护作用[8]。CTG能够显著改善帕金森模型小鼠的神经行为、抑制脑黑质多巴胺神经元的数量减少[9]。通过增强自由基清除酶活性、防止脂质过氧化、抑制β-淀粉样肽在脑内的沉积以及抑制脑细胞凋亡，CTG显著提高β-淀粉样肽所致阿尔采末病小鼠的学习记忆能力[10]。本研究显示，应用CTG预处理后，大鼠血BUN、Cr、胱抑素C含量显著下降，肾功能损害减轻，CTG使得I/R损伤肾组织中凋亡抑制蛋白XIAP增加，阻断细胞凋亡的发生，对损伤肾脏起到了保护作用。
【参考文献】
[1] Cassis P, Azzollini N, Solini S, et al. Both darbepoetinalfa and carbamylated prevent kidney graft dysfuntion due to ischemia reperfusion in rats [J]. Transplantation, 2011,92： 271-279.
[2] West T, Stump M, Lodygensky G, et al. Lack of X-linked inhibitor of apoptosis protein leads to increased apoptosis and tissue loss following neonatal brain injury[J]. Asnuro, 2009,1(1)： 43-52.
[3] Xiaobing B, Huiming T, Deiven W, et al. Multiple organ injuries and failures caused by shock and reperfusion[J]. J Trauma， 1996,40： s135-139.
[4] Padanilam BJ. Cell death induced by acute renal injury： a perspective on the contributions of apoptosis and necrosis[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2003,284： F608-F627.
[5] Galb
n S, Hwang C, Rumble JM, et al. Cytoprotective effects of IAPs revealed by a small molecule antagonist[J]. Biochem J, 2009,417(3)： 765-771.
[6] 吴建国，张丹，吴新胜，等，小鼠急性缺血-再灌注肾损伤模型的建立及体会[J].医学信息手术学分册，2007,20(12)： 1103-1105.
[7] 朱祖成.肉苁蓉总苷对大鼠脑缺血再灌注脑组织兴奋性氨基酸的作用[J].安徽医药,2010,14(12)： 1393-1395.
[8] Wuliya Y, Wang XW, Wubuli AS, et al. Protection effect of total glycosides of cistanche deserticola on lacking oxygen[J]. Rep Chin Pharm, 2003,20(1)： 73-76.
[9] 李文伟,杨茹,蔡定芳,等.苁蓉总苷对MPTP帕金森模型小鼠脑黑质多巴胺能神经元保护作用的研究[J].中国中西结合杂志,2008,28(3)： 248-251.
[10] 刘凤霞,王晓雯,罗兰,等.肉苁蓉总苷对β-淀粉样肽所致阿尔采末病小鼠模型学习记忆的影响极其机制[J].中国药理学通报,2006,22(5)： 295-299.
Protective effect of cistanche total glycosides pretreatment againstrenal ischemia reperfusion injury in rats
【Abstract】Objective To investigate the effect of cistanche total glycosides (CTG) on renal ischemia reperfusion injury in rats. Methods Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups： sham operation group, model group and CTG group with 10 in each. Renal ischemic and reperfusion injury was induced by hemorrhagic shock and resuscitation in rats of model and CTG groups. Intraperitoneal injection of 400mg/kg CTG was given to rats in CTG group, and injection of 3ml normal saline was given to rats in model and sham operation groups. The serum creatinine (Cr), blood urea nitrogen (BUN), and cystatin C levels were measured, apoptosis of renal cells was detected with flow cytometry; the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP)in renal tissue was determined with ELISA method. Results Compared to model group, blood Cr, BUN and cystatin C in CTG group were significantly decreased (P<0.01), renal cell apoptosis was attenuated (P<0.01), and the expression of XIAP was increased (P<0.05). Conclusion CTG can protect renal tissue against ischemia reperfusion injury, which may be related to up-regulation of the expression of XIAP.
【Key words】kidney; ischmia reperfusion injury; cistanche total glycosides; X-linked inhibitor of apoptosis protein; apoptosis； rats
doi：10.16118/j.1008-0392.2015.02.009
收稿日期：2014-11-20
基金项目：上海市科学技术委员会科研计划项目(034119942)
【中图分类号】R 692
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2015)02-0037-04