±s表示，采用SPSS 17.0软件进行数据分析，组间比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。·基础研究·
【摘要】目的 观察鼠卵巢癌模型在顺铂化疗前后雌激素水平的变化，评估顺铂腹腔化疗对卵巢功能的影响。方法 取8周龄裸鼠36只，随机分为空白对照组(A组，n=8)、肿瘤细胞接种后不化疗组(B组，n=12)、肿瘤细胞接种后静脉化疗组(C组，n=8)、肿瘤细胞接种后腹腔化疗组(D组，n=8)。所有裸鼠均行一侧附件切除术，除A组外，术中向其余3组鼠腹腔内注射卵巢癌细胞悬液。于术后第9天对A组和B组裸鼠腹腔内注入生理盐水，C组裸鼠尾静脉注射顺铂(20μg/g)+腹腔内注射生理盐水，D组裸鼠腹腔内注射顺铂(20μg/g)。第1次化疗后第0、10、20天分别取鼠尾静脉血测量雌激素水平。化疗22d后重复第1次化疗方法1次。于第2次化疗后第10、20及30天分别取鼠尾静脉血测量雌激素水平。结果 腹腔内接种肿瘤细胞后B、C及D组裸鼠雌激素水平明显高于A组(P<0.05)，A与B组的雌激素水平相对稳定，C和D组雌激素水平在化疗后显著降低，但C组高于D组(P<0.05)，随着化疗后时间延长,C与D组裸鼠雌激素水平逐渐下降至A组水平(P>0.05)。结论 顺铂化疗会损伤卵巢功能，腹腔化疗对卵巢皮质的损伤可能大于静脉化疗，随着化疗间隙期的延长卵巢功能可以得到恢复。
【关键词】卵巢肿瘤； 动物研究； 腹腔化疗； 顺铂； 雌激素； 小鼠
卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁妇女的健康，近年来卵巢癌发病有年轻化趋势。随着社会发展，女性生育年龄后移，部分卵巢癌患者在发病时尚未生育，有强烈的生育要求。卵巢癌传统手术方案需要切除双侧卵巢及子宫，使得患者丧失生育功能。最近研究证实，对有生育要求的Ⅰ期卵巢癌患者，保留对侧卵巢及子宫手术后生存率与经典手术方案相近。但卵巢癌患者术后常需要化疗，腹腔化疗是化疗方法的新途径，能够改善卵巢癌患者的预后，但腹腔化疗时腹腔药物高浓度是否会影响患者卵巢功能尚无研究报道。本研究拟对卵巢癌模型鼠进行模拟手术及顺铂腹腔和静脉化疗，通过测定化疗对鼠雌激素水平变化，研究顺铂腹腔化疗对卵巢功能的影响，探讨腹腔化疗在保留生育功能的卵巢癌手术中的意义，为早期卵巢癌患者保留生育功能治疗提供新思路。
1.1 肿瘤细胞培养
通过购买获得卵巢癌细胞株(HO-8910)，采用含10% Gibico胎牛血清的1640培养液进行肿瘤细胞培养，每3～4d细胞换液1次。待贴壁肿瘤细胞融合至80%时进行传代，待细胞培养至足够量进行动物实验。用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，PBS清洗2次，将细胞浓度调整至1×107/ml备用。
1.2 动物分组
取8周龄的雌性SPF级BALB/c-nu裸鼠36只，随机分为手术空白对照组(A组，n=8)、手术+肿瘤细胞接种后不化疗对照组(B组，n=12)、手术+肿瘤细胞接种后静脉化疗组(C组，n=8)、手术+肿瘤细胞接种后腹腔内化疗组(D组，n=8)。
1.3 卵巢癌动物模型的建立
对所有4组试验裸鼠行一侧附件切除术，术中除了A组外，向其余3组裸鼠腹腔内注射卵巢癌肿瘤细胞悬液，每只裸鼠注射细胞悬液 0.15ml(细胞浓度1×107/ml)，以模拟保留生育功能的卵巢癌手术及可能存在的腹腔内播散。手术当日使用青霉素预防感染。按文献[1]方法笼养8d备用，随机取B组鼠4只处死，观察腹腔内及卵巢表面肿瘤细胞种植及生长情况，并制病理切片分析，评估模型制作情况。
1.4 实验方法
术后第9天对A组和B组小鼠腹腔内各注入 2ml 生理盐水，C组小鼠尾静脉注射用 0.2ml 生理盐水稀释的顺铂(20μg/g)+腹腔内注射1.8ml生理盐水，向D组小鼠腹腔内注射用2ml生理盐水稀释的顺铂(20μg/g)。于第1次化疗第0、10、20天分别取鼠尾静脉血测量雌激素水平。采用断尾取血法取血，取血时注意将鼠尾擦拭干净，亦需避免杂物、粉尘落入取血的EP管内(300μl，用前需高压灭菌)，避免溶血，每只裸鼠血容量约 2ml，每次每只小鼠取血约300μl，取血后静置 1h，待血液凝固，离心半径 8cm, 1000r/min，离心2min，离心后用微量移液器小心吸取上面的血清，取50～100μl血清用于ELISA实验。取好的血清标记后可置4℃冰箱保存，若需长期保存可放于 -80℃ 冰箱内。第1次化疗后第22天重复第1次化疗方法1次。于第2次化疗后第10、20、30天分别取鼠尾静脉血测量雌激素水平。
1.5 统计学处理
数据以±s表示，采用SPSS 17.0软件进行数据分析，组间比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 卵巢癌动物模型的制作情况
肿瘤细胞种植笼养8d后随机处死B组4只裸鼠，病理制片后均在卵巢和腹膜表面有肿瘤细胞种植成活,见图1、2。
图1 卵巢肿瘤种植病理
Fig.1 Histopathology of inoculated ovarian caricinoma (H-E，×100)
图2 腹膜种植病理
Fig.2 Histopathology of inoculated peritoneal ovarian carcinoma(H-E，×100)
2.2 各阶段实验鼠体内雌激素变化情况
A组和B组雌激素水平在各阶段相对稳定，A组明显低于B组。腹腔内接种肿瘤细胞后B、C及D组雌激素水平明显高于A组(P<0.05)，且基本位于同一水平。C和D组雌激素水平在化疗后显著降低，但C组高于D组(P<0.05)，随着化疗后恢复时间延长,C与D组雌激素水平逐渐下降至 A组水平(P>0.05)，见表1。
表1 研究各阶段实验鼠体内雌激素变化情况
Tab.1 The variation of estrogen level in each stage 
±s，pg/ml)
组别第1次化疗后第2次化疗后第0天第10天第20天第10天第20天第30天A组428.90±40.96393.19±81.83567.45±140.85555.32±148.58517.23±229.04446.28±60.70B组1119.74±230.011048.23±285.431292.61±190.871266.30±289.621258.06±186.071099.82±328.29C组1090.34±213.35924.83±67.651427.12±205.70920.57±105.97646.33±77.33507.12±74.41D组1091.97±213.33446.69±146.501230.47±192.12502.76±131.76583.00±210.03399.84±75.44
卵巢癌的转移以腹腔内种植和播散为主，术后辅以顺铂腹腔化疗是有效的,而且比静脉化疗具有更多的优点： 一方面可使腹腔内局部高浓度抗癌药物与腹腔内可能残存的肿瘤直接接触，增加对肿瘤细胞的杀伤能力；另一方面，抗癌药大部分经门静脉吸收流入肝脏，有利于门静脉内癌细胞和肝实质内微小转移灶的治疗，而且全身吸收少，肝脏的解毒作用也减少了体循环内药物的毒性作用，提高了药物最大耐受量[1-2]。因此认为它是一种合理而可行的治疗方式。但对早期未生育卵巢癌患者，在有条件保留子宫及一侧卵巢的情况下，除G1的ⅠA和ⅠB期不需化疗以外，其余患者辅以化学治疗是必要的[3]，即使有以上的共识，对早期病例的预防性化疗仍被采用。因此，在开展腹腔化疗的同时，高浓度的化疗药物是否构成对留存卵巢功能的损伤，特别是卵巢生育功能的影响，目前资料不多。本研究采用治疗剂量的顺铂对卵巢癌模型鼠行腹腔与静脉单药化疗来观察卵巢雌激素变化情况以了解卵巢功能的变化，为临床相关研究积累资料。
鼠卵巢癌的模型制作有许多方法，且较为成熟。较早的人卵巢癌细胞系异种移植是通过在裸鼠皮下移植肿瘤细胞的方法来完成的。这种方法后来被广泛应用于新药治疗疗效的评价[4]。1993年Fu 等[5]首次尝试在小鼠体内进行人卵巢肿瘤原位移植。移植结果提示，卵巢癌肿瘤组织能在裸鼠体内原位生长，并保留自身原组织学特性及在小鼠腹腔内转移的能力。Agarwal等[6]报告用人卵巢癌细胞株(NIH-OVCAR3)通过腹腔灌注建立动物模型，取得成功，并成为该类研究的标准制模方法。李静等[7]报告国内开始有卵巢癌原位种植成功的研究。张骄等[8]将裸鼠原位移植瘤的模型制作做了进一步的报告，但其制模难度仍较大。本研究采用腹腔灌注制模，卵巢癌细胞株为HO-8910，向裸鼠腹腔内注射卵巢癌肿瘤细胞悬液，笼养8d后随机取4只鼠处死后病理均在卵巢和腹膜表面有肿瘤细胞种植成活，并在后续研究中测得雌激素较正常对照鼠明显升高，在化疗后快速降低，其变化与文献报告的肿瘤细胞可以产生雌激素、在化疗杀灭肿瘤细胞后的激素变化相一致[9]。
卵巢分泌的雌激素是通过位于卵巢皮质的卵泡膜细胞与颗粒细胞共同合成的，而卵巢表面没有腹膜的保护，单层生发上皮是否能抵御高浓度顺铂对卵泡膜细胞及颗粒细胞的不利影响，从而影响体内雌激素的分泌，阻碍卵泡发育及排卵，目前没有相关资料。本研究通过不同分组测定雌激素变化情况，试图间接探索顺铂腹腔化疗对卵巢生育功能的影响。在测定周期中，空白对照组与肿瘤模型未化疗组的雌激素水平均相对稳定，但B组数据明显高于A组，两组差异有统计学意义(P<0.05),这与牟瀚舟等[9]报告的由于种植的卵巢癌肿瘤细胞具有分泌雌激素的功能相一致，也进一步佐证了裸鼠腹腔内注射卵巢癌模型制作的有效性。同样在采用静脉和腹腔化疗组中，其雌激素水平随化疗药物对卵巢癌细胞的杀灭作用而明显降低，但静脉组的雌激素水平高于腹腔化疗组(P<0.05)，提示腹腔化疗对卵巢分泌雌激素功能存在一定的影响，但不排除其对肿瘤细胞的杀灭有效性好于静脉化疗而导致雌激素水平较低。而随着化疗间期的延长，两者的雌激素水平均与A组接近，提示即使腹腔化疗可能造成卵巢功能暂时的抑制，但随着化疗恢复期的延长其功能可以得到恢复。
总之，本研究在采用向裸鼠腹腔内注射卵巢癌肿瘤细胞悬液，制作裸鼠卵巢癌模型后，测定顺铂静脉和腹腔化疗卵巢雌激素变化情况，提示腹腔化疗与静脉化疗对卵巢癌细胞均有杀灭作用，腹腔化疗的疗效可能好于静脉化疗，但对卵巢皮质的损伤可能大于静脉化疗，随着化疗间隙期的延长卵巢功能可以得到恢复。
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Effects of intraperitoneal chemotherapy with cisplatin on serum estrogen levels in mice ovarian carcinoma model
【Abstract】Objective To investigate effects of intraperitoneal chemotherapy with cisplatin on serum estrogen levels in mice ovarian carcinoma model. Methods Thirty six female BALB/c-nu nude mice of 8 weeks were randomized into four groups： mice in group A(n=8) served as blank controls; mice in group B(n=12) were inoculated with ovarian carcinoma HO-8910 cells; mice in group C(n=8) were inoculated with HO-8910 cells and received intravenous injection of 20μg/g cisplatin at the 9th day after surgery; mice in group D(n=8) were inoculated with ovarian carcinoma cells and received intraperitoneal injection of 20 μg/g cisplatin. Blood samples were taken via caudal vein on d0, 10, 20 after chemotherapy and serum estrogen levels were measured. The chemotherapy was repeated on the 22ed day, and estrogen levels were measured on d10, 20, 30 after the second chemotherapy. Results With the inoculation of cancer cells, the estrogen levels were significantly increase in groups B, C, D, compared to that in group A(P<0.05), then the estrogen levels were suppressed by chemotherapy in group C and D. The estrogen levels in group D were significantly lower than that in group C(P<0.05). On d30 after second chemotherapy, the estrogen level of group A, C and D had no significant difference(P>0.05). Conclusion Chemotherapy can suppress ovarian function, intraperitoneal chemotherapy may be more toxic than intravenous chemotherapy; meanwhile ovarian function may gradually recover after chemotherapy.
【Key words】ovarian tumour； animal experiment； intraperitoneal chemotherapy； cisplatin； estrogen; mouse
doi：10.16118/j.1008-0392.2015.02.004
收稿日期：2015-01-08
基金项目：上海市卫生和计划生育委员会基金(WSJ1204)
【中图分类号】R 737.31
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2015)02-0016-04