前期及胎儿生长受限等发病机制中的作用已备受重视[6-7]，而关于RSA绒毛组织中ET-l及其受体的表达情况尚无明确报道。本研究检测URSA绒毛组织中ET-1及受体mRNA及蛋白的表达，同时检测ET-1及受体对滋养细胞迁移能力的影响，探讨其与URSA的关系。·基础研究·
【摘要】目的 通过检测内皮素-1(endothelin-1, ET-1)及受体(endothelin receptors, ETR)在不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)绒毛组织中的表达，探讨其与URSA的关系。方法 不明原因复发性流产患者30例(RSA组)及正常早孕人流妇女30例(正常组，即CTL组)，采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)及Western印迹法检测两组绒毛组织中ET-1、ETR-A、ETR-B mRNA及蛋白的表达。取体外培养的妊娠早期绒毛外滋养细胞Transwell迁移实验法检测ET-1、ETR-A阻断剂BQ-123及ETR-B阻断剂BQ-788受体对绒毛外滋养细胞迁移能力的影响。结果 RSA组较正常组绒毛组织中ETR-B mRNA及蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而ET-1、ETR-A mRNA及蛋白在二组绒毛组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。ET-1促进HTR-8细胞迁移，ETR-B阻断剂阻断ET-1的促迁移作用。 结论 ET-1可能通过ETR-B受体促进妊娠早期绒毛外滋养细胞迁移，URSA患者较正常组绒毛中ETR-B mRNA及蛋白表达降低可能与URSA相关。
【关键词】不明原因复发性流产; 绒毛; 内皮素-1; 内皮素受体; 迁移
复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)是指连续发生2次或2次以上自然流产者。病因复杂，主要包括遗传因素、子宫解剖异常、感染因素、内分泌异常、血栓前状态、免疫紊乱等，除此之外，仍有50%病因不明，称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)[1]。正常人类胎盘形成依赖绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblast, EVT)对子宫内膜间质及血管结构的浸润，完成子宫螺旋动脉的重铸，以建立母胎血液循环。已知在RSA中，绒毛浸润是严重缺失的，可导致滋养细胞过度凋亡和母体螺旋动脉不完全栓塞等诱发流产[2-3]。而滋养细胞迁移及浸润过程受母胎界面微环境中的多种因素调控。
内皮素-1(endothelin-1, ET-1)是迄今为止发现的最强的血管活性肽类物质，其不仅具有缩血管作用，作为激素调节肽和生长因子尚具有促进细胞增殖、迁移、浸润等作用[4]。内皮素受体(endothelin receptor, ETR)有ETR-A和ETR-B二种亚型，前者主要介导血管收缩和增殖，后者主要介导血管舒张及细胞迁移浸润。研究发现ET-1及其受体表达于人类胎盘滋养细胞[5]，参与妊娠生理、病理机制调节。近年来ET-1及其受体在子前期及胎儿生长受限等发病机制中的作用已备受重视[6-7]，而关于RSA绒毛组织中ET-l及其受体的表达情况尚无明确报道。本研究检测URSA绒毛组织中ET-1及受体mRNA及蛋白的表达，同时检测ET-1及受体对滋养细胞迁移能力的影响，探讨其与URSA的关系。
1.1 标本来源及采集
选择2014年1月至2014年6月在同济大学附属第一妇婴保健院接受治疗的30例URSA患者为RSA组。入组条件： (1) 二次自然流产史及以上；(2) 无生殖道畸形；(3) 无内分泌异常；(4) 无绒毛染色体异常；(5) 无 生殖道感染；(6) 无自身抗体阳性和自身免疫性疾病。同期就诊要求终止妊娠的30例正常早孕妇女为正常组，即CTL组。入组条件： (1) 停经后无不规则阴道出血；(2) 超声提示宫内妊娠，有心管搏动；(3) 既往无自然流产病史。RSA组年龄28～35岁，平均(31.23±2.29)岁；孕周7～12周，平均(9.24±1.12)周；正常组年龄 28～34岁，平均年龄(30.77±2.08)岁；孕周7～10周，平均(8.84±1.21)周，两组年龄及孕周比较差异无统计学意义(P>0.05)。在无菌操作下采集两组妇女离体绒毛，用PBS液清洗，放置-80℃液氮保存。
1.2 细胞株
HTR-8细胞株，购于中科院上海生命科学研究院细胞中心。
1.3 试剂
RNA提取试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自美国TaKaRa公司，BCA-100蛋白质定量测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Anti-ET抗体、Anti-ETRA抗体、Anti-ETRB抗体购自美国Abcam公司。
1.4 方法
1.4.1 实时荧光聚合酶链反应(Real-Time PCR) 取液氮中保存的绒毛组织，研磨成粉末，按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度计上测定RNA纯度及浓度。每份样品取1μl，按照反转录试剂盒说明书进行cDNA合成，引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表1。按照SYBR Green荧光定量试剂盒进行PCR反应，反应条件： 预变性95℃ 30s，PCR反应(95℃ 5s， 60℃ 30s)40个循环。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法进行基因相对表达分析。
表1 ET-1 、ETR-A、ETR-B mRNA 基因引物序列
Tab.1 Tthe primer sequences of ET-1, ETR-A and ETR-B mRNA
基因基因引物序列(5'-3')片段ET-1上游TGCTCCTGCTCGTCCCTGATGGATA-AAGAG462bp下游GGTCACATAACGCTCTCTG-GAGGGCTTETR-A上游AGTCGTGTTCAGGGAATTGG115bp下游AGGGTACCATGACGAAGCCGETR-B上游TCCCGTTCAGAAGACAGCTT231bp下游CAGAGGGCAAAGACAAGGACGAPDH上游ACTCCACGACGTCTCAGCG278bp下游GGTCGGACTCAACGGATTTG
1.4.2 Western印迹法检测 取液氮中保存绒毛组织，研磨后加入组织裂解液，匀浆液离心后取上清，采用BCA法进行蛋白含量测定。取20μl蛋白质经10%SDS-PAGE垂直凝胶电泳，后电转移至PVDF膜上，加适量5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入一抗(鼠抗人ET-1单克隆抗体、兔抗人ETRA、ETRB多克隆抗体，1∶1000 封闭液稀释)，室温孵育2h。用TBST漂洗3次，每次5min。加入二抗(羊抗兔或鼠的HRP-IgG，1∶2000稀释)，室温振荡孵育1h。TBST洗膜，滴加ECL发光试剂，显影、摄片。以GAPDH为内参，采用凝胶图像分析系统进行蛋白相对表达分析。
1.4.3 细胞迁移试验 HTR-8细胞置于含1%青链霉素、10%胎牛血清的DMEM-F12完全培养液中，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞生长至对数期，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞。将Transwell小室插入24孔细胞培养板,分别在上室铺设9种不同处理因素的细胞悬液。对照组： 1%FBS培养基；ET-1刺激组： 1%FBS培养基，0.01、0.1、1、10nmol/L四组浓度ET-1；ET-1受体阻断剂组： 1%FBS 培养基，0.1nmol/L ET-1，1、10μmol/L浓度ETR-A阻断剂BQ-123或ETR-B阻断剂BQ-788。将HTR-8细胞按照5×103/孔的密度接种于9组不同培养基中；下室分别给予10%FBS培养基800μl。置37℃、5%CO2培养箱培养24h。培养结束后，下室加入1μl荧光染色剂染色，继续置37℃、5%CO2培养箱培养0.5h。荧光显微镜下拍照(×100，4个 固定视野拍照)，计数迁移至下层的细胞数。
1.5 统计学处理
采用SPSS 16.0统计软件，计数资料用
±s表示，t检验相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 RSA组与正常组绒毛中ET-1、ETR-A、ETR-B mRNA 的表达
RSA组及正常组绒毛组织中均表达ET-1、ETR-A、ETR-B mRNA， RSA组绒毛中ETR-B mRNA表达较正常组显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而ET-1、ETR-A mRNA在两组绒毛中表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。
图1 RSA组及正常组绒毛中ET-1、ETR-A、 ETR-B mRNA表达情况
Fig.1 mRNA expression of ET-1, ETR-A and ETR-B in villi of women with URSA and normal pregnancy 与CTL组相比，*P<0.05
2.2 RSA组及正常组绒毛中ET-1、ETR-A、ETR-B蛋白的表达
在蛋白水平上RSA组及正常组绒毛组织中均表达ET-1、ETR-A、ETR-B，RSA组绒毛中ETR-B蛋白表达低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)，而ET-1、ETR-A蛋白在两组绒毛中表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。
2.3 ET-1及受体对HTR-8细胞迁移能力的影响
运用Transwell迁移实验检测ET-1及受体对HTR-8细胞迁移能力的影响，在0.01nmol/L ET-1组，HTR-8迁移细胞数较对照组增加25%，差异有统计学意义 (P<0.05)，在 0.01～10nmol/L不同浓度ET-1组中， HTR-8迁移细胞数随ET-1浓度增加而增加，呈剂量依赖。在两组ETR-A阻断剂组中， HTR-8迁移细胞数较相同浓度 ET-1组差异无统计学意义 (P>0.05)。在两组 ETR-B阻断剂组中， 1μmol/L BQ-788组HTR-8迁移细胞数较相同浓度ET-1组减少42.32%，10μmol/L BQ-788组HTR-8迁移细胞数较相同浓度ET-1组减少79.44%，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3、4。
图2 RSA组及正常组绒毛中ET-1、ETR-A、 ETR-B蛋白表达情况
Fig.2 Protein expression of ET-1, ETR-A and ETR-B in villi of women with URSA and normal pregnancy 与CTL组相比，*P<0.05
图3 ET-1和ETR阻断剂对HTR8细胞迁移的影响
Fig.3 The role of ET-1 and ETR antagonist in the regulation of HTR-8 cell migration
A： 对照组及不同浓度ET-1(0.01、0.1、1、10nmol/L)对HTR-8细胞迁移的影响；B： ET-1(0.1nmol/L)及不同浓度ETR阻断剂BQ123、BQ788对HTR8细胞迁移的影响；与ET组相比，*P<0.05
图4 ET-1及ETR阻断剂对HTR8细胞迁移的影响
Fig.4 The role of ET-1 and ETR antagonist in the regulation of HTR-8 cell migration
A： 对照组；B： 0.01nmol/L ET-1组；C： 0.1nmol/L ET-1组；D： 0.1nmol/L ET-1+10μmol/L BQ-788组
人类妊娠滋养层细胞来源于胚胎的胚外层，包括细胞滋养细胞、合体滋养细胞、绒毛外滋养细胞三个亚群。在胚胎植入过程中，滋养层细胞具有类似肿瘤细胞侵袭和转移的特性，通过绒毛外滋养细胞对母体蜕膜的侵袭及螺旋动脉的重塑过程，促进胎盘形成[8]。适当的滋养细胞侵入深度对胎盘的成功植入至关重要，滋养细胞侵袭不足可能造成自然流产、子前期及胎儿生长受限等疾病的发生[9]。这一侵蚀过程，受多种旁分泌及自分泌因子的严格调控，包括多种细胞因子、生长因子、生长因子结合蛋白、蛋白多糖和细胞外基质蛋白及激素等[10]。
ET-1是一类血管活性肽类物质及生长因子，具有调节血管紧张度、促进细胞增殖、浸润、迁移等作用，ETR-A和ETR-B对增殖均起作用，而浸润仅通过ETR-B起作用。Cervar等[4]研究表明，在妊娠早期，滋养细胞主要表达ETR-B受体，支持ETR-B受体促进滋养细胞迁移、侵袭，在晚期胎盘中，ETR下降，ETR-A主要分布在绒毛膜板及绒毛干等近端绒毛的血管组织中，而ETRB主要分布在中间绒毛及末端绒毛中，ET受体在妊娠早期和妊娠晚期胎盘的定位与表达水平不同，提示ETR在胎盘发育中起着不断变化的作用[5]。本研究结果显示： RSA组绒毛中ETR-B mRNA及蛋白表达低于正常组，而ET-1、ETR-A mRNA及蛋白表达差异无统计学意义，由此猜测，URSA绒毛组织中ETR-B mRNA及蛋白表达降低，滋养细胞迁移、侵袭能力下降，可能影响子宫血管重铸，导致胎盘“浅着床”，可能与流产有关。
绒毛外滋养细胞具有高度迁移、侵袭功能，HTR-8细胞是体外扩增的绒毛外滋养细胞体系，其具有原位绒毛外滋养细胞表型及功能特性。本研究HTR-8细胞迁移结果显示，ET-1促进HTR-8细胞迁移，并呈剂量依赖，ETR-B阻断剂BQ-788阻断ET-1促进迁移的作用。由此推测ET-1可能通过ETR-B受体促进妊娠早期绒毛外滋养细胞迁移，在局部环境中适当浓度的ET-1及受体可能对胚泡正常发育、着床起重要作用。
综上所述，妊娠早期ET-1可能通过ETR-B受体促进绒毛外滋养细胞迁移，URSA绒毛组织中ETR-B mRNA及蛋白表达水平明显降低，有助于进一步探讨ET-1与URSA发病的关系。
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Expression of endothelin-1 and endothelin receptors in villi and its relation to unexplained recurrent spontaneous abortion
【Abstract】Objective To investigate the expression of endothelin-1(ET-1) and endothelin receptors(ETRs)in villi and its relation to unexplained recurrent spontaneous abortion(URSA). Methods The expressions of ET-1, ETR-A, ETR-B mRNA and protein were determined with Real-Time PCR and Western blotting in villi tissue of 60 early pregnancy women(30 URSA and 30 normal pregnancy), respectively. Extravillous trophoblast(EVT) HTR-8 cells were treated with ET-1, ETR-A antagonist BQ-123 and ETR-B antagonist BQ-788, respectively. The migration function of HTR cells was assessed by Transwell assay. Results Compared to normal controls the levels of ETR-B mRNA and protein in villi tissue of URSA women were decreased(P<0.05)，while there was no significant difference in ET-1 and ETR-A mRNA and protein levels between two groups(P>0.05).The migration of HTR-8 cells was stimulated by ET-1 and the migration-promoting was blocked in the presence of the ETR-B antagonist. Conclusion The results indicate that ET-1 promotes EVT migration through ETR-B in the first trimester of gestation, and the downregulated expression of ETR-B might be involved in the etiology of URSA.
【Key words】unexplained recurrent spontaneous abortion; villi; endothelin-1; endothelin receptor; migration
doi：10.16118/j.1008-0392.2015.02.002
收稿日期：2015-01-18
【中图分类号】R 711
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2015)02-0006-05