表示，采用统计学软件SPSS 13.0进行分析，使用单因素方差分析进行组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。·基础研究·
【摘要】目的 观察核素介导生长抑素类似物对非小细胞肺癌(non-small celllung cancer, NSCLC)细胞的体外杀伤作用。方法 MTT法测定核素介导生长抑素类似物对人肺癌细胞A549和SPC-A1增殖的影响，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell侵袭实验验证核素介导生长抑素类似物对肿瘤侵袭的影响。结果 2～6d内，核素介导生长抑素类似物对A549和SPC-A1细胞的抑制率随时间延长明显增加。经核素介导生长抑素类似物处理48h后，A549和SPC-A1细胞凋亡率分别为23.1%和22.6%。与对照组相比，核素介导生长抑素类似物处理过的A549和SPC-A1细胞侵入胶原的数量减少了约1/3。结论 核素介导生长抑素类似物具有诱导NSCLC细胞凋亡的作用，这可能为NSCLC的放射治疗提供了新的思路。
【关键词】生长抑素类似物； 核素介导； 非小细胞肺癌； 体外杀伤
大多数非小细胞肺癌(non small cell lung cancer， NSCLC)患者在进入晚期之后才被发现，仅有20%可接受手术治疗，且术后复发和转移率超过50%[1]。一线含铂两药联合方案是目前公认的标准化疗方案，但治疗有效率仅为30%左右，而且接受化疗的患者最终都会失效[2]，即使采用同步放化疗，患者长期生存仍较差[3]。以放射性粒子植入为基础的综合治疗只是姑息治疗手段，不是根治手段，且有气胸、出血、疼痛、低热、放射性损伤，包括急性放射性肺炎和放射性肺纤维化等并发症[4]。因此，应开发出一些通过调节异常信号通路而直接靶向于肿瘤细胞的新型治疗药物，在减少不良反应的同时，为患者带来更佳的疗效。
本研究观察核素介导生长抑素类似物(188Re-MAG3-depreotide)对非小细胞肺癌细胞的体外杀伤和荷瘤裸鼠肿瘤放射性核素靶向治疗作用，为实现非小细胞肺癌受体介导治疗提供新的可能途径。
1.1 材料
188W/188Re发生器购自上海科兴药业公司；CRC-15R型放射性核素活度计购自美国Capintec公司；Cytomics FC500型流式细胞仪购自美国Beckman公司；SN-695B型放免γ测量仪购自上海核所日环光电仪器有限公司；人肺癌细胞株A549和SPC-A1由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供。裸鼠20只由上海实验动物研究所提供，3～4周龄，平均体质量 20～25g，用于建立NSCLC肿瘤模型。
1.2 方法
1.2.1 188Re标记MAG3-depreotide及标记率和放化纯的测定 将MAG3-depreotide溶于醋酸胺溶液，逐滴加入酒石酸盐溶液和氯化亚锡溶液，最后加入200μl的740mBq/L 188ReO4洗脱液，反应液在室温下放置15～30min后，测定标记率。标记物经过Sephadex G25柱纯化，分步收集，确定洗脱峰位置，测定放化纯度。
1.2.2 A549和SPC-A1细胞培养 将人肺癌细胞株A549加用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化传代，约1周后肿瘤细胞的总体数量可以满足实验要求。将处于对数生长期的NSCLC细胞株SPC-A1置于含15%小牛血清的RPMI-1640完全培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞长到80%～90%融合时，倾去培养液，用PBS溶液洗涤2次后，经0.25%胰酶消化，制成单细胞混悬液，以2×105/孔的浓度接种于48孔培养基中生长24h。实验当天细胞生长至单层接触融合时，吸弃培养基，用PBS清洗2次后备用。
1.2.3 188Re-MAG3-depreotide对A549和SPC-A1细胞的杀伤效应 分别收获对数生长中期、生长状态良好的NSCLC细胞株A549和SPC-A1，然后加入200μl的RPMI-164培养基和100μl的37mBq/L 188Re-MAG3-depreotide(终浓度为12.3mBq/L)，在37℃孵育60min，每组设8个平行孔。分别从第 2～6天采用MTT法检测细胞生长情况。每天取出一块培养板，向每孔加入新鲜配制的MTT液(5mg/ml)20μl,继续培养4h,吸去孔内上清液,每孔加人二甲基亚砜150μl,振荡10min,结晶物充分溶解后在酶联免疫检测仪上检测570nm波长处光密度值(D570)。计算细胞生长抑制率，公式为： 抑制率=[(对照组D值-实验组D值)÷对照组D值]×100%。
1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 NSCLC细胞株A549和SPC-A1生长在完全培养基中，以0.25%胰蛋白酶消化后，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为5×105/ml，接种在细胞培养瓶中培养，次日加入100μl的37 mBq/L的188Re-MAG3-depreotide(终浓度为12.3mBq/L)，同时设不加188Re-MAG3-depreotide为空白对照。12h后，去掉加样的培养基，用完全培养基洗涤2遍，再加入完全培养基继续培养至48h，0.25%胰蛋白酶消化，轻轻吹打为单细胞悬液，PBS洗3遍，离心后加入Binding Buffer 200μl 重悬细胞，单个细胞悬液先加10μl Annexin V-FITC，室温避光反应30min，再加入5μl PI，室温避光反应5min，再加Binding Buffer工作液400μl即可上机。
1.2.5 Transwell侵袭实验 将Transwell置于24孔培养板中，各加入50μl的上述混合液于上室。将100μl 37mBq/L的188Re-MAG3-depreotide处理过的A549和SPC-A1及其对照细胞用无血清DMEM培养基制成1×106/ml的细胞悬液。处理过的细胞用4℃的pH为7.4的PBS洗涤2次，完全洗脱188Re-MAG3-depreotide。取出上室，用棉拭子擦除未能侵袭的细胞后，中性甲醛固定30min，常规H-E染色；于200倍光学显微镜下，随机选取5个视野计数浸润细胞，取平均值进行比较。
1.2.6 188Re-MAG3-depreotide的毒性及热原实验 将标记溶液经微孔无菌滤膜处理后，微生物学检查进行需氧菌、厌氧菌和霉菌实验，热源检查： 鲎试验参照《中华人民共和国药典》(1995年版)附录中细菌内毒素检查法。
1.3 统计学处理
所有数据以表示，采用统计学软件SPSS 13.0进行分析，使用单因素方差分析进行组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 188Re-MAG3-depreotide的标记率和放射化学纯度
在生理盐水的展开剂Ⅰ中，胶体和标记物位于原点，而游离188Re则展开至前沿；在85%酸化乙醇(pH 3.5)中，胶体停留在原点，而游离188Re和标记物迁移至展开剂前沿。新华Ⅰ号纸层析测定188Re标记MAG3-depreotide标记物的标记率>80%，比活度达到200GBq/mmol，放化纯可达到90%，表明标记物可以较好地满足实验要求。
2.2 MTT法测定188Re-MAG3-depreotide对细胞增殖的影响
2～6d内，标记物对A549和SPC-A1细胞在的抑制率如表1所示，可见随时间延长，抑制率均明显增加，在第6天时达到最大，为50%～60%。188Re-MAG3-depreotide对A549和SPC-A1细胞的抑制率未见明显统计学差异(P>0.05)，但该标记物具有明显抑制体外培养NSCLC细胞生长增殖的作用。
2.3 流式细胞仪检测
A549和SPC-A1细胞经188Re-MAG3-depre-otide处理48h后，收集5×105～5×106个细胞，根据试剂盒说明书进行Annexin V/PI双染色，然后立即用流式细胞仪检测，结果见图1。AnnexinV-FITC用Ⅰ双标记流式细胞术可以将实验样本中正常、坏死、凋亡细胞区分开。以FITC和PI荧光作双参数点图，细胞分为四个群，Q1群： AnnexinV-FITCˉ、Pl+，代表机械损伤细胞；Q2群： AmiexinV-FITC+、PIˉ，为早期凋亡细胞；Q3群： AnnexinV-FITCˉ、Plˉ，代表活细胞；Q4群： AnnexinV-FITC+、PI+为凋亡晚期或坏死细胞。结果表明，A549和SPC-A1细胞经188Re-MAG3-depreotide处理48h后均表现出了明显的凋亡，凋亡率分别为23.1%和22.6%。
表1 标记物对A549和SPC-A1细胞各时间点抑制率
Tab.1 Inhibition rate of A549 and SPC A1 cells at different time points
细胞2d3d4d5d6dA54913.62±4.7523.48±7.1331.05±6.4342.17±7.8850.32±9.20SPC-A115.29±4.8727.26±5.1839.03±8.6550.01±6.3959.44±7.92
图1 Annexinv-FITC/PI双标记流式细胞凋亡检测结果
Fig.1 Annexinv-FITC/PI double labeling flow cytometry for detection of cell apoptosis
2.4 Transwell侵袭实验
188Re-MAG3-depreotide处理过的A549和SPC-A1细胞侵袭实验表明，处理组细胞侵袭力明显减弱，和其对照组相比，侵入胶原的细胞数量减少了约1/3(P<0.05)，见图2。
图2 A549和SPC-A1细胞侵袭实验
Fig.2 Transwell assay for A549 and SPC A1 cells
188Re与99mTc同属Ⅶ族元素，化学性质相近，标记多种放射性药物的可能性更大，应用范围更广。将188Re标记于某些特异性分子上进行肿瘤内照射治疗，可以提高治疗肿瘤的靶向性。188Re是理想的治疗用放射性核素，其半衰期为16.7h，可以发射最大能量为2.12 MeV的β射线。188Re发射的β射线能量适中，组织内照射射程短，最大组织射程11mm，95%的β射线在4mm范围内被吸收，对周围组织损伤小，特别适用于内照射治疗；188Re同时还发射0.155 MeV的γ射线用于显像，可进行核素的生物学分布情况、辐射剂量及药代动力学研究。188Re发射的β射线电离辐射能力强，表面剂量高，梯度剂量明显，直接引起生物大分子的损伤，导致细胞凋亡；使肿瘤组织遭受损害，导致细胞繁殖能力丧失、代谢紊乱失调、细胞衰老或死亡等生物效应；还可电离小分子产生过氧化氢等氧自由基，间接加速细胞凋亡，从而达到治疗的目的。利用188Re及其标记物进行肿瘤内照射治疗的机制正是基于以上188Re所具有的物理特性及生物学作用[5]。
研究[6]发现，188Re能诱导乳腺癌ER-75-30、前列腺癌PC-3等肿瘤细胞发生凋亡形态学和生化特征变化。边惠洁等[7]探讨188Re内照射对肝癌细胞HCC的细胞周期阻断及诱导凋亡作用，结果显示188Re导致的HCC细胞死亡具有典型的细胞凋亡形态学特征。以上研究结果表明，188Re具有诱导癌细胞凋亡和直接杀伤癌组织的作用，为临床应用提供了理论依据。
本实验用188Re-MAG3-depreotide对NSCLC细胞株进行了放射性治疗，发现188Re-MAG3-depreo-tide抑制了NSCLC细胞株A549和SPC-A1的增殖和侵袭，表明188Re-MAG3-depreotide具有诱导NSCLC凋亡的作用，为NSCLC的放射治疗提供了新的思路。
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Nuclide-mediated somatostatin analogues induces apoptosis of non-small cell lung cancer cells in vitro
【Abstract】Objective To investigate the effect of nuclide-mediated somatostatin analogues on non-small cell lung cancer (NSCLC) cellsin vitro. Methods Cultured NSCLC A549 and SPC-A1 cells were treated with nuclide-mediated somatostatin analogues. Cell proliferation was determined by MTT method, cell apoptosis was detected by flow cytometry, and cell invasion ability was measured by Transwell migration assay. Results Nuclide-mediated somatostatin analogues inhibited proliferation of A549 and SPC-A1 cells in a time-dependent manner within 2-6 d. The apoptosis rates of A549 and SPC-A1 cells treated by nuclide-mediated somatostatin analogues for 48h were 23.1% and 22.6%, respectively. Transwell assay showed that the number of migrant A549 and SPC-A1 cells after treatment was decreased to one third. Conclusion Nuclide-mediated somatostatin analogue induces apoptosis, inhibits proliferation and invasion of NSCLC A549 and SPC-A1 cells.
【Key words】somatostatin analogues; nuclide mediated; non-small cell lung cancer; killerin vitro
doi：10.16118/j.1008-0392.2015.01.003
收稿日期：2014-08-19
基金项目：国家自然科学基金(81301993)
【中图分类号】R 734.2
【文献标志码】A
【文章编号】1008-0392(2015)01-0009-04